ما هي الالتهابات التي تحدد المجموع. ماذا تعني نتيجة ELISA الإيجابية (المقايسة المناعية الأنزيمية)؟

- دراسة معملية حديثة ، يتم خلالها البحث عن أجسام مضادة محددة في الدم أو مستضدات لأمراض معينة من أجل تحديد ليس فقط مسببات المرض ، ولكن أيضًا مرحلة المرض. يمكن إصدار نتائج ELISA نوعيًا وكميًا.

حاليًا ، يتم استخدام ELISA في المواقف التالية:

1) البحث عن أجسام مضادة محددة لأي مرض معدي ؛
2) البحث عن مستضدات أي أمراض (أمراض معدية ، تناسلية) ؛
3) البحث الحالة الهرمونيةالمريض؛
4) فحص علامات الورم.
5) فحص الوجود أمراض المناعة الذاتية.

مزايا طريقة ELISA:

1) الدقة والنوعية العالية لطريقة ELISA (أكثر من 90٪).
2) القدرة على تحديد المرض وتتبع ديناميات العملية ، أي مقارنة كمية الأجسام المضادة في فترات زمنية مختلفة.
3) توافر تشخيص ELISA في أي مؤسسة طبية.

عيب نسبي:

1) تحديد الاستجابة المناعية (الأجسام المضادة) ، ولكن ليس العامل الممرض نفسه.

مفاهيم أساسية

قبل توضيح جوهر طريقة ELISA ، دعنا نفهم بإيجاز بعض المفاهيم.
الأجسام المضادة (أو الغلوبولين المناعي - Ig) - بروتينات معينة ينتجها B -
الخلايا الليمفاوية (الخلايا المناعية) استجابةً لابتلاع أي ممرض معدي (فيروسات ، بكتيريا ، فطريات ، إلخ). هناك الغلوبولين المناعي A (IgA) ، الغلوبولين المناعي E (IgE) ، الغلوبولين المناعي M (IgM) ، الغلوبولين المناعي G (IgG) ، الغلوبولين المناعي D (IgD). وهي تختلف عن بعضها البعض في الشكل الجزيئي والكتلة ، والعمر النصفي ، والمشاركة / عدم المشاركة في العمليات المعدية ، ووقت الكشف من لحظة الإصابة. إذا أخذنا في الاعتبار الوزن الجزيئي ، فغالباً ما يمتلكه IgM - فهو خماسي (950000 دالتون) ، على عكس باقي Ig (من 150 إلى 200000 Da) ، نظرًا لأن IgM لا يمكنه المرور عبر حاجز المشيمة. لذلك ، فإن اكتشاف IgM في طفل يبلغ من العمر سنة واحدة هو دائمًا علامة على إصابة الجنين. في مصل الدم ، يتم تمثيل الجزء الأكبر من الغلوبولين المناعي بواسطة IgG (75-85٪) ، وأقلها هو IgE (0.003٪). فقط IgA و M و G هم من يشاركون بشكل مباشر في العملية المعدية. IgE هي علامة ردود الفعل التحسسيةوالأمراض ، و IgD - يمكن العثور عليه فقط في أنسجة الغدد الليمفاوية واللوزتين ، ويلعب دورًا في تكوين المناعة المحلية.

المستضدات - المواد الجزيئية من أصل عضوي ، ولا سيما مسببات الأمراض المعدية والأمراض الأخرى ، وكذلك المواد من مختلف الخلايا المتغيرة التي تكونت في مرض معين (أمراض المناعة الذاتية ، علم الأورام).

مجمع المناعة - مركب مستضد - جسم مضاد يشارك في عملية المناعة.

ما هو أساس طريقة ELISA.

هناك عدة أنواع من ELISA (طريقة مباشرة ، غير مباشرة ، منع ، تنافسية) ، ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، غالبًا ما يتم استخدام المقايسة المناعية غير المتجانسة للطور الصلب أو ELISA (مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم)

أساس مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم هو التفاعل المناعي لمستضد وجسم مضاد مع تكوين مركب مناعي: جسم مضاد للمستضد ، مما يؤدي إلى تغيير في النشاط الأنزيمي لملصقات معينة على سطح الأجسام المضادة.

بعبارات بسيطة ، يمكن تقسيم هذه العملية إلى عدة مراحل:

1) على سطح آبار قرص الطبيب الذي يجري الفحص ، يوجد مستضد منقى لممرض معين. عند إضافة المواد البيولوجية(مصل الدم) للمريض ، يحدث تفاعل محدد بين هذا المستضد والجسم المضاد المطلوب (الغلوبولين المناعي). هذا المركب سيكون بمثابة "مستضد خاص" في الخطوة التالية.

2) في هذه المرحلة ، يتم تكوين الأشعة تحت الحمراء (المجمعات المناعية) - التفاعل بين "المستضد الخاص" والمقارن (هذا هو الغلوبولين المناعي المسمى بإنزيم البيروكسيداز). يضاف كروموجين خاص. نتيجة هذا التفاعل الإنزيمي هو تكوين مادة ملونة في بئر القرص ، وتعتمد شدة اللون على كمية الغلوبولين المناعي (الأجسام المضادة) الموجودة في مادة المريض.

3) بعد ذلك ، يتم تقييم النتيجة: القياس الضوئي باستخدام مقياس الطيف الضوئي متعدد القنوات ، مقارنة الكثافة البصرية لمواد الاختبار مع الكثافة البصرية لعينات التحكم ، المعالجة الرياضية للنتائج. تعتمد كمية الأجسام المضادة في المريض بشكل مباشر على ارتفاع الكثافة البصرية لبئر معين.

عادة ، يتم استخدام 96 لوحة جيدة في الممارسة.

عند قياس الكثافة الضوئية (OD) لسائل الاختبار ، يتم حساب عدد (أو تركيز) الأجسام المضادة في وحدة حجم معينة. ثم تتم مقارنة النتيجة بعينة تحكم.

عليك أن تتذكر:لكل نظام اختبار ، يتم تطوير المؤشرات الفردية لمراعاة النتائج ومؤشرات القاعدة وعلم الأمراض (أي "القيم المرجعية"). يجب أن يؤخذ ذلك في الاعتبار عند تقييم نتائج كل دراسة محددة. ليس من الصحيح تفسير نتائج أحد المختبرات من "القيم المرجعية" لمختبر آخر. كما أنه من الخطأ مقارنة نتائج المختبرات المختلفة مع بعضها البعض.

عند إعداد تفاعلات ELISA ، فإن مفهوم مثل نشاوة الجسم المضاد مهم أيضًا.
شغف الجسم المضاد - هذه هي قوة الرابطة بين الجسم المضاد والمستضد وكمية المستضد المرتبطة بالجلوبيولينات المناعية (الأجسام المضادة). للشهوة أهمية كبيرة في تقييم المدة المتوقعة للعدوى ، وهو أمر مهم للغاية في تشخيص العدوى الأولية عند النساء الحوامل.

يتكون أساس اختبار شغف الجسم المضاد من معالجة المركب المناعي (مستضد - جسم مضاد) بمحلول اليوريا لتدمير البروتين. تظل الروابط شديدة التعطش سليمة ، في حين يتم تدمير الروابط منخفضة الشدة. يتم إعطاء النتيجة كمؤشر شغف ، معبراً عنها كنسبة مئوية (٪).

ما هي الأمراض التي يتم اكتشافها بواسطة تشخيص ELISA؟

2. علامات أمراض المناعة الذاتية ومؤشرات مناعة الإنسان(إجمالي IgE ، إجمالي IgG ، إجمالي IgA ، إجمالي IgM ، إجمالي IgD ، إفرازي IgA ، IgG 2 ، IgG4 ، معقدات مناعية CEC ، IgA و IgG إلى gliadin وغيرها)

3. علامات الأورام(TNF - عامل نخر الورم ، CEA - مستضد السرطان الجنيني ، PSA - مستضد البروستات النوعي ، قوات حرس السواحل الهايتية - موجهة الغدد التناسلية المشيميةو CA 125 و alveomucin وغيرها الكثير)

4. الاضطرابات التناسليةأنا (استراديول ، بروجسترون ، برولاكتين ، هرمون تستوستيرون ، بروتين ألفا ألفافيتوبروتين ، FSH - هرمون منشط للجريب وغيرها)

5. الأمراض الغدة الدرقية (حر ومربوط T3 ، T4 ، ثيروجلوبولين ، ثيروبيروكسيداز - TPO ، هرمون تحفيز الغدة الدرقية - TSH).

لا يتم تمثيل هذه القائمة بجميع الأمراض التي يتم تشخيصها باستخدام المقايسة المناعية الإنزيمية.

مواد لتحليل ELISA وقواعد جمعها

المادة الأكثر شيوعًا لتفاعل ELISA هي مصل دم المريض ، ويتم تناوله على معدة فارغة. يمكن أن تكون المادة أيضًا بمثابة السائل النخاعي والسائل الأمنيوسي والمحتوى الزجاجي والمخاط قناة عنق الرحموالإحليل ، مسحات.

تحضير المرضى لتسليم المواد الخاصة بـ ELISA

وقت إنتاج ELISA

يتم إجراء التحليل المناعي للمادة بسرعة ، في غضون يوم واحد. يمكن أن يكون التأخير في المعامل المختلفة بسبب تراكم كمية معينة من الأمصال.

النتائج المحتملة لتشخيص ELISA

عند تقييم نتائج عدوى معينة ، فإن فئة الأجسام المضادة المكتشفة وعددها مهمان. هذا لا يحدد فقط مسألة مسببات العدوى (سواء كان ذلك أم لا) ، ولكن أيضًا المرحلة المتوقعة من المرض (الحاد ، المزمن) ، وكذلك وجود عدوى نشطة (حادة أو تفاقم مزمن) في وقت الفحص.

ما هو التوقيت التقريبي لظهور الأجسام المضادة (الغلوبولين المناعي - Ig)؟

أقدم الأجسام المضادة هي IgM. يمكن اكتشافها بعد 1-3 أسابيع من الإصابة المحتملة التي تميزها مرحلة حادةعملية معدية. الحالة الثانية لظهور الأجسام المضادة IgM هي تنشيط (أو تفاقم) عملية مزمنة. تنتشر الأجسام المضادة IgM في المتوسط ​​لمدة 3 أشهر تقريبًا ، ثم يختفي عددها تدريجيًا. ومع ذلك ، في بعض المرضى ، قد يتم الكشف عن كميات ضئيلة من IgM في غضون 1-2 سنوات من الإصابة.

أنظمة الاختبار الحديثة حساسة للغاية ، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة غير محددة (غالبًا عند النساء الحوامل). لذلك ، في هذه المجموعة من المرضى ، يجب إعادة فحص IgM الإيجابي!

تظهر الأجسام المضادة IgA بعد 2-4 أسابيع من الإصابة ، ولكن بكمية كافية للكشف - بعد شهر. يتم تصنيع المصل IgA خلايا البلازماالطحال والغدد الليمفاوية والأغشية المخاطية ، يتركز إفراز IgA على الأغشية المخاطية لأداء وظيفتها الوقائية - فهي تشارك في المناعة المحلية.

من الأسبوع الرابع بعد الإصابة ، تبدأ الأجسام المضادة IgG في الظهور. في معظم حالات العدوى ، يزداد عيارها تدريجيًا بحد أقصى تواريخ مختلفة(بمعدل 1.5-2 شهرًا) ، ثم يظل العيار عند مستوى منخفض ويشير إلى المناعة. في بعض الأمراض (الميكوبلازما ، الكلاميديا ​​، داء المشعرات) ، مستوى IgG ليس مرتفعًا ، ينخفض ​​بشكل كبير بسبب نقص المناعة في هذه الالتهابات.

خيارات الكشف عن الأجسام المضادة من الفئات المختلفة:

يقترح الكشف المعزول عن الأجسام المضادة IgM وجود أولي
الالتهابات.
- يعتبر الاكتشاف المتزامن لـ IgM و IgG في الدم من سمات الإصابة الأولية
في الأشهر 2-3 السابقة ، وكذلك أثناء تفاقم مرض مزمن. لذلك ، أثناء الحمل ، لا يكون وجود IgM دائمًا علامة على الإصابة الأولية.
- قد يشير الكشف عن IgG في عزلة إلى كلا من المناعة لهذا المرض ،
وكذلك العدوى المزمنة. في الحالة الثانية ، كل من كمية الأجسام المضادة (العيار) والتغير في هذا العيار بمرور الوقت مهمان. عادة ، يتم إجراء الدراسات على فترات من 2-4-6 أسابيع.
- الكشف عن IgA وحده أو مع IgM يشير إلى وجود عدوى أولية. في
من المتوقع تنشيط مظهر IgA مع IgG عدوى مزمنة(في المتوسط ​​أسبوعين من لحظة التفاقم).

تعريف شغف الأجسام المضادة IgG هي خطوة تكميلية ممتازة في تشخيص العدوى الأولية من عدوى طويلة الأمد لها عدوى خاصة بها الأهمية السريرية، خاصة عند تقييم خطر إصابة الجنين بالعدوى داخل الرحم. يشير اكتشاف IgG منخفض الشغف إلى وجود عدوى أولية ويتم اكتشافه في المتوسط ​​بعد 4-6 أشهر بعد الإصابة ، ونادرًا ما يكون أطول. تتطلب مستويات IgG المنخفضة الشغوف تأكيدًا مختبريًا آخر للعدوى الأولية (IgM). الأجسام المضادة الشديدة هي إما علامة على مرض مزمن وتفاقمه ، أو مناعة متطورة.

الميزات عند الرضع:في الأطفال حتى سن عام ، وأحيانًا 1.5 سنة ، IgG للأم التهابات مختلفة(أي أنهم اخترقوا المشيمة من الأم إلى الجنين أثناء نمو الجنين). هم ليسوا في حد ذاتها علامة على وجود عدوى في الوقت الحاضر. إذا تم اكتشاف IgM في هذا العمر (تذكر أن IgM للأم لا يمكنه عبور المشيمة) ، فهذه علامة على وجود عدوى داخل الرحم أو عدوى مكتسبة بعد الولادة.

طريقة ELISA الكمية

يتم إصدار نتيجة تشخيص ELISA (باستخدام محلل المقايسة المناعية الإنزيمية) في وحدات قياس معينة:
- الكثافة البصرية (OD) للعينة هي تركيز الأجسام المضادة المحددة لكل وحدة حجم. كلما زاد OD للعينة ، زاد تركيز الجسم المضاد. بعض النتائج تتحدث عن معامل الإيجابية (PC) - وهي أيضًا الكثافة البصرية للعينة.
- وحدات تركيز الجسم المضاد (نانوجرام / مليلتر أو نانوغرام / مل).
- في شكل عيار مصل: 1:20 ، 1:40 ، 1: 100 ، 1: 200 ، 1: 400 ، 1: 800 ، 1: 1200 وهكذا. التتر التشخيصي (الذي يتم فيه تشخيص المرض وليس حقيقة العدوى) يختلف باختلاف الأمراض.
- في شكل رموز - "+" ، "-" ، "؟" (+، ++، +++، ++++).
- مثل التقييم النوعيوفقًا لمعيار معين (إيجابي أو سلبي).

تقييم كمية الأجسام المضادة بشكل صحيح ، وهو نوع من الكشف عن فئة الغلوبولين المناعي ، وبالتالي ، يمكن للطبيب فقط تحديد مرحلة المرض والحاجة إلى العلاج.

يجب ألا ننسى أنه بالنسبة لأي نظام اختبار ، يتم تطوير "القيم المرجعية" الخاصة بهم (متغيرات القاعدة) ، إذا تم تجاوزها ، يتم تشخيص مرض معين (متغيرات علم الأمراض). بالنسبة لأنظمة الاختبار المختلفة ، تختلف "القيم المرجعية".

لا يمكن إجراء مقارنة صحيحة لنتائج ELISA المأخوذة في الديناميكيات إلا إذا تم إجراؤها في نفس المختبر.

أخصائي الأمراض المعدية Bykova N.I.

حاليا قيد الإستعمال كمية كبيرةأنواع وتعديلات مختلفة من ELISA. واسع الانتشار متغيرات مختلفةمقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

تم اقتراح المرحلة الصلبة ELISA في عام 1971. المبادئ الأساسية لمرحلة ELISA الصلبة ، بغض النظر عن التعديل ، هي كما يلي:

• 1. في المرحلة الأولى من التفاعل ، يتم امتصاص المستضدات أو الأجسام المضادة على المرحلة الصلبة. في هذه الحالة ، يمكن إزالة الكواشف غير المرتبطة بالمرحلة الصلبة بسهولة عن طريق الغسيل.
• 2. تحضن عينة الاختبار في الآبار الحساسة. تحتوي آبار التحكم الإيجابي على كواشف قياسية. في هذه الحالة ، تتشكل المجمعات المناعية على سطح المرحلة الصلبة. تتم إزالة المكونات غير المربوطة عن طريق الغسيل.
• 3. عند إضافة إنزيم - جسم مضاد أو اتحاد إنزيم - مستضد وربطه بالمركب المناعي الثابت ، يظل الموقع النشط للإنزيم متاحًا للتفاعل اللاحق مع الركيزة. يؤدي احتضان الركيزة في الآبار بمقارن غير متحرك إلى تطوير تفاعل لوني. يمكن إيقاف هذا التفاعل في المرحلة المرغوبة ، ويمكن تقييم شدة التلوين بصريًا أو بالكثافة البصرية. خطوة مهمة في أي متغير لتحليل المرحلة الصلبة هي إجراء غسل الكواشف غير المقيدة. من المهم ليس فقط شطف المكونات المثبتة على المرحلة الصلبة ، ولكن إزالة الكواشف من عمق الطبقة بالكامل. يمكن غسل العينات تلقائيًا بغسالة أو يدويًا باستخدام ماصة متعددة القنوات. لإجراء اختبار ELISA ، أنت بحاجة إلى:
  • · قرص بوليسترين أو غيره من خيارات الطور الصلب المستخدمة ؛
  • محلول الغسيل
  • متقارن (مستضدات أو أجسام مضادة موصوفة بالإنزيم) ؛
  • خليط الركائز المستخدمة ؛
  • وقف الحل (وقف الكاشف - الحل لوقف التفاعل) ؛
  • العينات المستخدمة للمراقبة الإيجابية و / أو السلبية ؛
  • مستضد قياسي (لبناء منحنى معايرة) ؛
  • ماصات أحادية ومتعددة القنوات ؛
  • · غسالة؛
  • جهاز بصري لتحديد الكثافة الضوئية لمحلول الاختبار (قارئ ELISA ، قارئ يقوم بمقاييس ضوئية متتابعة لجميع الآبار) ؛
  • · 5-100 مايكرولتر من المادة البيولوجية المدروسة.

إليسا المباشر

1. يتم امتصاص المستضدات أو الأجسام المضادة (مادة الاختبار) في آبار الألواح. في كثير من الأحيان في ELISA المباشر ، يكون المستضد المعطل في المرحلة الصلبة هو الخلايا ومستضدات الجسيمات الأخرى.

يتحكم. كعنصر تحكم ، يتم استخدام الآبار التي تحتوي على عينة تحكم إيجابية ممتصة ، والتي تحتوي بالضرورة على المستضد المطلوب ، وعينة تحكم سلبية ، من الواضح أنها لا تحتوي على مستضد الاختبار. في حالة وجود مستضد معياري منقى ، يتم إجراء التفاعل بعدة تخفيفات بحيث يمكن إنشاء منحنى معايرة.

• 2. "حجب مواقع الربط الحرة المتبقية على الطور الصلب باستخدام الكازين BSA ، وما إلى ذلك (لمنع الامتصاص غير المحدد للمقارن على المرحلة الصلبة).
• 3. تضاف الأجسام المضادة أو المستضدات الموصوفة بالإنزيم (المتقارن) إلى الآبار وتحضينها. لن يحدث ربط الاتحاد بالطور الصلب إلا إذا كان كلا مكونين من النظام مكملين. بعد الحضانة مع الاتحاد ، يتم غسل الآبار ، وبالتالي إزالة الجزء غير المرتبط من الاتحاد.

• 4. ثم يتم إضافة الركيزة الخاصة بالإنزيم المستخدم إلى الآبار وحضنها. عندما يتم الوصول إلى المستوى الأمثل للتلطيخ في آبار التحكم الإيجابية ، يتم إيقاف تفاعل الإنزيم.
• 5. المحاسبة لرد الفعل. أولاً ، تؤخذ نتائج التفاعل بعين الاعتبار بصريًا. للحصول على حساب أكثر دقة للنتائج ، يتم تقييم كثافة التلوين على قارئ ELISA مع مرشح ضوء مناسب. بناءً على نتائج التحليل ، تم إنشاء رسم بياني لاعتماد الكثافة الضوئية على التركيز. تثبيت الأجسام المضادة لامتصاص ELISA
• أ) للكشف عن مستضد ؛ ب) لاكتشاف الأجسام المضادة.

ELISA غير المباشر.

عادة ما يستخدم هذا البديل من ELISA للكشف عن أجسام مضادة معينة. يتم امتصاص المستضد القياسي في آبار الألواح وحضنته مع عينات من مصل الدم أو مواد بيولوجية أخرى تم الحصول عليها من المريض (السائل النخاعي واللعاب وما إلى ذلك). يتم الكشف عن أجسام مضادة محددة مرتبطة بمولد الضد على الطور الصلب باستخدام اتحاد مضاد للجلوبيولين. اعتمادًا على الغرض من التحليل ، يتم استخدام كواشف مختلفة من مضادات الغلوبولين التي تكشف عن الأجسام المضادة لجميع الأنماط المتساوية ، أو خاصة بالفئات الفردية والفئات الفرعية من الغلوبولين المناعي. الميزة الرئيسية للطريقة هي عالمية المرافق. يمكن استخدام نفس الاتحاد لاكتشاف الأجسام المضادة البشرية لمجموعة متنوعة من المستضدات في أي عينة. رد الفعل بسيط منهجيًا.

المراحل الرئيسية لـ ELISA غير المباشر للكشف عن الأجسام المضادة:

• 1. يُمتص المستضد على الطور الصلب ، ثم يغسل من المكونات غير المرتبطة.
• 2. منع مواقع الربط المجانية. مغسول.

• 3. تضاف مادة الاختبار إلى الآبار ، ثم تحضن ثم تغسل. في موازاة ذلك ، يتم وضع العينات ذات الضوابط الإيجابية والسلبية.
• 4. إضافة مضادات الغلوبولين المتقارن في تخفيف العمل ، واحتضان ، وغسل المكونات غير منضم.
• 5. يتم إدخال الركيزة ، المحتضنة. عند الوصول إلى المستوى الأمثل للتلطيخ في آبار التحكم الإيجابية ، يتم إيقاف التفاعل بإضافة محلول الإيقاف.
• 6. قم بقياس كمية منتج التفاعل على قارئ ELISA.

في ظل ظروف الفحص المثلى ، تكون الطريقة محددة وحساسة للغاية. يسمح لك باكتشاف كميات نانوجرام من الأجسام المضادة في مصل المرضى الخاضعين للدراسة. للحصول على نتائج مرضية ، من الضروري توحيد الكواشف والمنهجيات. يمكن أيضًا استخدام متغير ELISA لاختبار الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.

"ساندويتش" - نوع من ELISA للكشف عن المستضدات.

يجب أن تحتوي المستضدات المكتشفة باستخدام متغير ELISA هذا على حواتم ربط متعددة للأجسام المضادة أو لها حواتم متكررة ومنفصلة مكانيًا لها نفس الخصوصية.

عند تنفيذ هذا البديل من ELISA ، يتم تحضين الأجسام المضادة متعددة أو وحيدة النسيلة عالية النوعية الممتزة على الطور الصلب مع عينة الاختبار. بعد إجراء الغسيل ، تتم إضافة الأجسام المضادة التي تحمل علامة الإنزيم (مترافقة) إلى نفس المستضد إلى الآبار ، ثم يتم تنفيذ جميع مراحل التفاعل الأخرى. تعتمد كفاءة تكوين معقد معين في كل مرحلة من مراحل التحليل على ثابت الارتباط لتفاعل الجسم المضاد للمستضد.

المراحل الرئيسية للتحليل:

• 1. يتم تجميد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو الأجسام المضادة متعددة النسيلة المنقاة بتقارب في المرحلة الصلبة.
• 2. يتم إدخال عينة الاختبار في آبار الألواح ، ويتم وضع عينة تحكم إيجابية وعينة تحكم سلبية بالتوازي في تخفيفات مختلفة. تحضين وتغسل.
• 3. تضاف الأجسام المضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة (مترافقة) الموصوفة بالإنزيم إلى الآبار. يتم الغسيل بعد الحضانة.
• 4. يتم إدخال الركيزة واحتضانها. يتم إيقاف التفاعل عندما يتحقق التلوين الأمثل في آبار التحكم الإيجابية.
• 5. المحاسبة عن النتائج على قارئ ELISA.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي حساسيتها العالية ، والتي تتجاوز قدرات مخططات ELISA الأخرى.

إليسا التنافسية.

يعتمد خيار التحليل هذا على المنافسة بين الأجسام المضادة المسمى (المترافق) وغير المُسمى (الاختبار) للارتباط بالمولد الضد الممتص على المرحلة الصلبة. ستنخفض كمية الإنزيم المرتبط بالمرحلة الصلبة بما يتناسب مع محتوى الأجسام المضادة الحرة في الخليط. لتحديد مولد الضد ، يتم استخدام نفس الخيار ، ولكن في هذه الحالة ، يتنافس المستضد المطلوب مع مولد الضد المعياري المسمى للارتباط بالأجسام المضادة المثبتة على سطح الطور الصلب.

تتطلب الطريقة التنافسية حدًا أدنى من العمليات ، واستهلاكًا منخفضًا للكواشف ، ويمكن تشغيلها تلقائيًا بسهولة. عند إجراء اختبار ELISA تنافسي للكشف عن الأجسام المضادة ، فمن الأفضل استخدام الأجسام المضادة أحادية الخلية المسمى ، ثم تحدث منافسة الاتحاد مع عينة الاختبار على حاتمة واحدة من المستضد الممتص على المرحلة الصلبة. يستخدم متغير ELISA لتحديد المركبات المختلفة ، مثل الغلوبولين المناعي البشري ، ومستضد السرطان الجنيني ، والأنسولين ، وما إلى ذلك. ويسمح باكتشاف الأجسام المضادة لتشخيص حواتم العوامل المعدية المهمة.

المراحل الرئيسية للتحليل للكشف عن المستضد:

• 1. يتم تجميد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة بالمستضد المراد اكتشافه في المرحلة الصلبة.
• 2. أضف المستضد المسمى بالإنزيم وعينة الاختبار بتركيز معروف في آبار الألواح. إجراء الحضانة والغسيل. بالتوازي ، يتم وضع الضوابط الإيجابية والسلبية في الآبار المجاورة. لبناء المعايرة باستخدام مستضد قياسي غير محدد في تخفيفات مختلفة.
• 3. أضف الركيزة ، احتضن ، أوقف التفاعل عندما يتطور تلطيخ مثالي في آبار التحكم الإيجابية.
• 4. المحاسبة لرد الفعل على قارئ ELISA.

في هذه الحالة ، تتناسب كمية المستضد في عينة الاختبار عكسًا مع النشاط الأنزيمي في المرحلة الصلبة.

إليسا المثبطة.

في هذا البديل من ELISA ، يرتبط المستضد الموجود في عينة الاختبار بالأجسام المضادة أحادية النسيلة المسمى بالإنزيم ويمنع تفاعلها مع المستضد القياسي المثبت في المرحلة الصلبة. إن وجود كميات ضئيلة حتى من المستضد الخاص بالمقارن في العينة سيمنع ارتباط الأجسام المضادة الموصوفة بالمستضد المعطّل. درجة التثبيط تتناسب طرديا مع محتوى المستضد في المحلول. للتحليل الكمي ، يتم إنشاء منحنى المعايرة باستخدام التخفيفات التسلسلية لمولد الضد القياسي. المراحل الرئيسية من ELISA المثبط للكشف عن المستضد (الشكل 6).

• 1. يمتص المستضد القياسي في آبار الألواح. حدد التخفيف العملي للأجسام المضادة المسمى عن طريق المعايرة.
• 2. يتم تحضين المتقارن مسبقًا في التخفيف العامل مع تخفيفات عينة الاختبار ، ومستضد قياسي وعينات تحكم إيجابية.
• 3. يتم نقل الخليط إلى آبار الألواح. للتحكم في الارتباط بنسبة 100٪ ، تتم إضافة الأجسام المضادة المميزة فقط إلى العديد من الآبار ، بدون مستضد مثبط. يتم تحضين الألواح ثم غسلها.
• 4. إضافة الركيزة.
• 5. سجل النتائج.

تركيز المستضد الذي سيتم تحديده في عينة الاختبار يتناسب عكسياً مع النشاط الأنزيمي في المرحلة الصلبة.

يمكن استخدام ELISA ليس فقط لتحديد مستضد قابل للذوبان أو جسم مضاد ، ولكن أيضًا الخلايا التي تنتج بروتينات مختلفة.

طريقة إنزيم المناعة (ELISPOT).

في عام 1983 ، تم تكييف تقنية ELISA للكشف عن الخلايا اللمفاوية التي تفرز الأجسام المضادة أو المستضدات (مثل السيتوكينات) في المختبر. تسمى هذه الطريقة ELISPOT (المقايسة المناعية الأنزيمية أو طريقة البقعة). المبدأ الرئيسي للطريقة:

• 1. يتم امتصاص المستضدات أو الأجسام المضادة على سطح بئر من البوليسترين (باستخدام 24 لوحة خلية بئر) ، والتي تعمل بمثابة كواشف "محاصرة".
• 2. تضاف الخلايا اللمفاوية المدروسة ، المزروعة لعدة ساعات عند 37 درجة مئوية ، مما يمنحها الفرصة لشغل مكان معين وأداء وظيفة إفرازية. يتم التقاط الأجسام المضادة أو المستضدات التي تفرزها هذه الخلايا بواسطة الكواشف الممتصة على الطور الصلب.
• 3. يتم إزالة الخلايا باستخدام محلول الغسيل مع منظف الخلية lysing المنظف.
• 4. تظهر مواقع تراكم المنتجات الإفرازية عن طريق إضافة الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم (كاشف مضاد الجلوبيولين).
• 5. يضاف خليط الركيزة - الاغاروز (يجب أن تذوب الركائز المستخدمة في الاغاروز وتشكل نواتج تفاعل غير قابلة للذوبان) ، وتتشكل بقع بنية أو زرقاء على سطح الطور الصلب (اعتمادًا على الإنزيمات والركائز المستخدمة) ، مما يكشف عن المناطق التي توجد فيها الخلايا.
• * يتم عد البقع الناتجة تحت المجهر ، وهذا سيكون عدد الخلايا المفرزة.

يمكن استخدام غشاء النيتروسليلوز كمرحلة صلبة.في هذه الحالة ، هناك عدد من المزايا: نظرًا لقدرة الامتصاص العالية لـ NCM ، مطلوب كمية أقل بكثير من المستضد المستخدم ككاشف "محاصرة" ، بالإضافة إلى ذلك ، ليست هناك حاجة لتضمين الاغاروز في الركيزة.

في تعريف موازعدد الخلايا المفرزة والكمية الإجمالية للمستضد أو الجسم المضاد المفرز في البئر ، وهو أمر ممكن عند استخدام ركيزة مختلفة ، فمن الممكن تحديد كمية المادة المفرزة بواسطة خلية واحدة.

تم العثور على هذه الطريقة تطبيق واسعلتقدير عدد الخلايا التي تفرز مستضدًا تم التقاطه بواسطة الأجسام المضادة الممتصة ، يتم استخدامه لتحديد عدد الخلايا التي تفرز السيتوكينات (IL-1 ، IL-2 ، IL-4 ، IL-6 ، IFN-y ، TNF-a).

أنظمة تضخيم الإشارة.

عند استخدام الأجسام المضادة عالية التقارب ، تكون حساسية متغيرات ELISA الفردية عالية جدًا ومن الناحية النظرية تجعل من الممكن اكتشاف جزيئات المستضد الفردي ، ولكن في الممارسة العملية ، تكون الحساسية محدودة بعدد من العوامل: نشاط الإنزيم ، وشدة الإشارة ، وطرق حساب الإشارة. تتيح أنظمة تضخيم الإشارة زيادة حساسية متغيرات ELISA المختلفة. ضع في اعتبارك بعض هذه الأنظمة:

بناءً على تفاعل أفيدين-بيوتين.

يتم ربط جزيئات البيوتين المساعد (m.m. 244 Da) مع الأجسام المضادة باستخدام biotinyl-N-hydroxysuccimide. حجم صغيرمن الأسهل ربط جزيء البيوتين بغلوبولين مناعي أو بروتين آخر دون انتهاك خصائصه المناعية أو الأنزيمية. يرتبط الإنزيم في هذه الحالة ببروتين بياض البيض أفيدين. إن ألفة ارتباط أفيدين بالبيوتين عالية جدًا (ثابت تفكك المعقد هو 10-15 مول) ، تم تثبيت اتحاد إنزيم أفيدين بشكل ثابت على معقد مستضد - جسم مضاد - بيوتين. بعد إضافة الركيزة المناسبة ، يتم تحديد ناتج التفاعل بطريقة القياس الطيفي أو عن طريق شدة التألق.

يتكون جزيء أفيدين من أربع وحدات فرعية متطابقة ، وهو قادر على التفاعل مع أربعة جزيئات من البيوتين ، مما يسمح باستخدامه كجزيء ربط بين مركبين يحتويان على البيوتين. في هذه الحالة ، يتم أيضًا معالجة الإنزيم بيوتينيل ، ويعمل أفيدين كجسر يربط بين جزيئين يحتويان على بقايا البيوتين. يضاف أفيدين المجاني إلى معقد المستضد - الأجسام المضادة - البيوتين الناتج ، متبوعًا بالإنزيم المعالج بالبيوتين. سجل رد الفعل.

يمكن امتصاص بروتين أفيدين بشكل غير محدد على جزيئات أخرى ؛ لذلك ، يتم استخدام بروتين آخر مرتبط بالبيوتين ، وهو الستربتافيدين ، الموجود في البكتيريا Streptomyces avidinii ، بشكل متزايد. يشكل الستربتافيدين أيضًا مركبًا قويًا مع البيوتين ويتكون من أربع وحدات فرعية متطابقة.

يتيح استخدام مركب أفيدين-بيوتين زيادة حساسية ELISA بشكل كبير ، حيث يمكن ربط العشرات من جزيئات البيوتين بجزيء AT واحد أثناء تخليق اتحاد. الحصول على اقتران (الأجسام المضادة والإنزيمات مع البيوتين) سهل للغاية ويصاحبه الحد الأدنى من التغييرات في نشاطها المناعي والإنزيمي. يمكن استخدام مقارنات الإنزيمات مع البيوتين ككواشف عالمية.

استخدام التفاعلات الكيميائية.

يمكن استخدام تفاعلات التلألؤ الكيميائي للحصول على إشارة في ELISA ، مع زيادة حساسية الطريقة وتقليل وقت التحليل. يستخدم بيروكسيداز الفجل على نطاق واسع كعلامة في ELISA ، ويمكن أيضًا استخدام تفاعلات كيميائية مختلفة للكشف عنه. تعتمد تفاعلات اللمعان الكيميائي على قدرة اللومينول على التوهج عند التأكسد باستخدام بيروكسيد الهيدروجين. في التحليل المباشر ، ينتج تفاعل إنزيمي بيروكسيد الهيدروجين ويؤكسد اللومينول ؛ يتم تحفيز هذا التفاعل بواسطة بيروكسيداز الفجل. لتعزيز الإشارة ، يتم استخدام مركبات مختلفة ، على سبيل المثال ، لوسيفيرين ، الفينولات ، في هذه الحالة ، يتم تحسين شدة اللمعان بمقدار 10-100 مرة ، في بعض الحالات بمقدار 500 مرة (التحليل الكيميائي المحسن). إشارة الإنارة مستقرة للغاية ، يصل مستواها إلى الحد الأقصى في 30 ثانية (للمقارنة: تفاعل اللون مع OPD كمؤشر يتطور بشكل كامل فقط في 30 دقيقة).

في التحليل غير المباشر باستخدام luminol أو مشتقاته ، يتم تمييز الجسم المضاد. مثل هذا الملصق في الحالة الحرة يمكن أن يتأكسد بواسطة بيروكسيد الهيدروجين مع إطلاق الضوء. إذا شكل معقدًا ، فإنه يفقد قدرته على الأكسدة.

على أساس أنظمة الشلال.

لزيادة حساسية ELISA ، يمكن استخدام أنظمة شلال الإنزيم. في هذه الحالة ، ينتج عن الإنزيم الأول المرتبط بالجسم المضاد ركيزة قابلة للاختزال لنظام الإنزيم الثاني. قد يكون نظام الإنزيم الثاني عبارة عن ركيزة - دورية أو دورة الأكسدة الحلقية. يمكن أن تكون الملصقات الأنزيمية في هذه الحالة عبارة عن فسفو جلوكويزوميراز ، ألدولاز ، الفوسفاتيز القلوية. المنتج النهائييتم تحديد التفاعلات بصريًا أو قياسًا ضوئيًا.

تحقق أنظمة تضخيم ELISA حساسية عالية. تُستخدم أنظمة ELISA لتحديد مستوى الهرمونات.

تحليل ELISA هو تقنية حديثة التشخيص المختبري كمية كبيرة امراض عديدة. يشير الاختصار إلى المقايسة المناعية للإنزيم. جوهر هذه التقنية هو تحديد عيار (نشاط) الأجسام المضادة.

تكتسب تقنية ELISA شعبية كبيرة اليوم. يتم تطبيقه في الطب السريريللتشخيص أمراض مختلفةوكذلك في الدراسات التجريبية التي تتطلب تحديدًا دقيقًا لتركيز المركبات المختلفة في الوسط المدروس.

مبدأ تقنية ELISA

ELISA هو تفاعل مناعي. يعتمد على إضافة أجسام مضادة محددة
أو المستضدات في وسط الاختبار (غالبًا دم الاختبار) مع التحديد الأنزيمي اللاحق لتركيز معقدات الجسم المضاد المستضد الناتجة. من خلال تركيز المركب ، يمكن للمرء أن يحكم على مستوى أو نشاط التحليل في وسط الاختبار.

عادة ما يتم تحديد تركيز معقدات الأجسام المضادة للمستضد باستخدام معدات خاصة بالطريقة الكروماتوغرافية.

مؤشرات لتنفيذ

يتم إجراء تحليل ELISA للعديد من المؤشرات ، أهمها في الطب السريري هي:

• تشخيص الأمراض المعدية التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي في الغالب (STI) ، والتي تشمل الكلاميديا ​​، وداء الميكوبلازما ، وداء البول ، وداء المشعرات ، بينما يتم الكشف عن الأجسام المضادة المحددة للعامل المعدي.
• تشخيص الأمراض المعدية توطين مختلفلتحديد المرحلة عملية مرضية، في المقام الأول في عملية تشخيص التهاب الكبد الفيروسي بالحقن وفيروس نقص المناعة البشرية.
• تحديد تركيز الهرمونات لتشخيص الأمراض المختلفة لأعضاء جهاز الغدد الصماء (الغدد الصماء).
• تحديد المركبات المختلفة لتشخيص سبب تسمم الجسم في حالة التسمم أو لدغات الحشرات أو الثعابين.

مع هؤلاء المؤشرات الطبيةيتم إجراء اختبار الدم ELISA. أيضًا هذه التقنيةتستخدم بنشاط في الطب التجريبي خلال مختلف الأبحاث السريريةأثناء تطوير عقاقير جديدة ، لقاحات للوقاية المناعية.

كيف تتم الدراسة

يتم إجراء اختبار الدم ELISA في مختبر متخصص. في السابق ، من أجل تنفيذه ، يتم أخذ الدم الوريدي ، عادة من الوريد المرفقي بحجم 5-10 مل ، ثم يتم إرساله إلى المختبر. في المتوسط ​​، يمكن الحصول على نتيجة التحليل في اليوم التالي ، وهي نقطة مهمة للتعيين الفوري للعلاج بعد تحديد تشخيص المرض.

كيف تستعد ل ELISA

للحصول على نتائج موثوقة للدراسة عن طريق المقايسة المناعية للإنزيم ، يجب اتباع بعض التوصيات التحضيرية البسيطة ، والتي تشمل:

• في اليوم السابق للاختبار ، يجب أن تتوقف عن الأكل الأطعمة الدسمةالطعام (اللحوم والمنتجات المدخنة) والكحول.
• يجب أن تؤخذ مواد البحث في الصباح على معدة فارغة.
• في يوم الدراسة ، من المستحسن تجنب الإجهاد البدني والنفسي والعاطفي.
• قبل الدراسة ، يجب أن تحاول ألا تدخن.

الأكثر استقبالا نتائج إيجابية خاطئةمقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم يرجع إلى التنفيذ غير السليم للتوصيات التحضيرية. يرتبط هذا في معظم الحالات بتناول الأطعمة الدهنية ، مما يؤدي إلى زيادة تركيز الدهون الثلاثية (الدهون) في بلازما الدم ، مما يقلل من خصوصية ELISA.

فك رموز النتائج

اختبار الدم للأجسام المضادة باستخدام ELISA له تعديلين - نوعي و الكميات. في
التحديد النوعي للأجسام المضادة ، يمكن أن تكون النتيجة إيجابية (يتم الكشف عن الأجسام المضادة ، مما يشير إلى احتمال وجود عملية مرضية يسببها العامل المعدي) أو سلبية (لا توجد أجسام مضادة ، مما يشير إلى عدم وجود عملية معدية).

لا يعتبر عدم وجود الأجسام المضادة دائمًا مؤشرًا بنسبة 100٪ على عدم وجود عملية معدية. هذا يرجع إلى حقيقة أنه بعد الإصابة ، لا تتشكل الأجسام المضادة على الفور ، ولكن خلال فترة زمنية معينة (على الأقل حوالي أسبوعين). لذلك ، لتأكيد عدم وجود عدوى ، يمكن تكرار ELISA بعد فترة.

باستخدام ELISA الكمي ، يتم تحديد عيار (نشاط) الأجسام المضادة ، وكذلك فئاتها. في معظم الحالات ، لتشخيص الأمراض المعدية ، يتم تحديد الأجسام المضادة من فئة IgG (الغلوبولين المناعي G) و IgM (الغلوبولين المناعي M) ، والتي تتشكل في الجسم على فترات مختلفة بعد الإصابة ، لذلك يمكن أن يكون لفك شفرة نتيجة التحليل عدة معانٍ:

• زيادة نشاط IgM وغياب IgG دليل على وجود عدوى حديثة و دورة حادةعملية معدية.
• زيادة نشاط IgM و IgG هو تفاقم العملية المعدية في مسارها المزمن والعدوى طويلة المدى.
• ارتفاع نشاط IgG ونقص IgM - مسار مزمنعملية معدية على خلفية عدوى طويلة الأمد ، وبعد مرور أكثر من ستة أشهر (الوقت اللازم لتشكيل الأجسام المضادة من فئة IgG).

بشكل عام ، تفسير نتائج ELISA لكل عملية معدية له ميزات معينة. يقوم الطبيب بتحديد أكثر دقة لوجود مرض معد ، وكذلك مرحلة مساره.

ELISA هي الطريقة المفضلة حاليًا لتشخيص معظم الأمراض المعدية. بناءً على نتائج هذه الدراسة ، يمكن للطبيب أن يثبت التشخيص الدقيقوتحديد مرحلة مسار العملية المرضية لتعيين العلاج اللاحق المناسب والفعال.

دخلت ELISA (مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، ELISA - الإنجليزية) حياة الطب العملي في مكان آخر في الستينيات من القرن الماضي. كانت مهمته الأولية هي البحث النسيجي للأغراض العلمية ، والتي اقتصرت على البحث والتعريف هيكل مستضديخلايا كائن حي.

تعتمد طريقة ELISA على تفاعل مستضدات معينة (AT) ومستضدات ذات صلة (AG) مع تكوين مركب مضاد لجسم مضاد ، والذي يتم اكتشافه باستخدام إنزيم. قادت هذه الحقيقة العلماء إلى فكرة أنه يمكن استخدام الطريقة لأغراض التشخيص لتحديد جلوبولين مناعي معين من فئات مختلفة تشارك في الاستجابة المناعية لعدوى معينة. وكان طفرة في التشخيص المختبري السريري!

بدأ استخدام الطريقة بنشاط فقط في أوائل الثمانينيات ، ثم بشكل أساسي في المؤسسات المتخصصة. تم تزويد مراكز ومحطات نقل الدم ، والمستشفيات المعدية والتناسلية ، بأول محللات مناعية مرتبطة بالإنزيم ، حيث ظهر معنا في الأفق مرض الإيدز الهائل ، المولود في القارة الأفريقية ، وانضم على الفور إلى العدوى "القديمة" ، مما تطلب إجراءات تشخيص وبحث فورية. مستحضرات طبيةالتي تؤثر عليه.

نطاق طريقة ELISA

إن إمكانيات المقايسة المناعية للإنزيم واسعة حقًا.من الصعب الآن تخيل كيف يمكن للمرء الاستغناء عن مثل هذه الدراسات ، والتي يتم استخدامها حرفيًا في جميع فروع الطب. يبدو أن ELISA يمكن أن تفعله في علم الأورام؟ اتضح أنه يمكن. والكثير. قدرة التحليل على إيجاد علامات خاصة ببعض الأنواع الأورام الخبيثة، يكمن وراءه الكشف المبكرالأورام ، بينما بطريقة أخرى لم يتم تحديدها بعد بسبب صغر حجمها.

التشخيصات المخبرية السريرية الحديثة (CDL) ، بالإضافة إلى علامات الورم ، لديها ترسانة كبيرة من الألواح لـ ELISA وتستخدمها لتشخيص الحالات المرضية المختلفة (العمليات المعدية ، الاضطرابات الهرمونية) ومراقبة الأدوية الصيدلانية من أجل تحديد تأثيرها على جسم المريض ، وبالمناسبة ليس فقط على الإنسان. حاليًا ، يستخدم الإنزيم المناعي على نطاق واسع في خدمة بيطرية، لأن "إخواننا الصغار" معرضون أيضًا للعديد من الأمراض التي يعانون منها كثيرًا في بعض الأحيان.

هكذا، يمكن لـ ELISA ، نظرًا لحساسيتها ونوعيتها ، تحديد ما يلي من عينة الدم المأخوذة من الوريد:

• الحالة الهرمونية (هرمونات الغدة الدرقية والكظرية والهرمونات الجنسية) ؛
• وجود فيروس و عدوى بكتيرية(فيروس نقص المناعة البشرية ، وباء وجيم ، والكلاميديا ​​، والزهري ، وكذلك العديد من الأمراض الأخرى التي تسببها الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض) ؛
• آثار النشاط الحيوي للكائنات الحية الدقيقة عملية معديةوالتي انتهت بنجاح وانتقلت إلى مرحلة تكوين استجابة مناعية لهذا العامل الممرض. تبقى هذه الآثار ، أي الأجسام المضادة ، في كثير من الحالات متداولة في الدم مدى الحياة ، مما يحمي الشخص من إعادة العدوى.

ما هو جوهر IF؟

تتيح طريقة المقايسة المناعية للإنزيم تحديد ليس فقط وجود العامل الممرض نفسه (التحليل النوعي) ، ولكن أيضًا محتواه الكمي في مصل دم المريض.

تؤثر الجرعة الفيروسية أو البكتيرية بشكل كبير على مسار العملية المعدية ونتائجها ؛ لذلك يلعب التحليل الكمي دورًا مهمًا في تشخيص وعلاج الأمراض في أشكال مختلفةوالمراحل.

ومع ذلك ، بمعرفة مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم كطريقة ELISA ، فإننا لا نفكر حتى في كيفية إدارتها لتغطية مثل هذا النطاق الواسع من الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش على كوكبنا ، والتي يشكل الكثير منها تهديدًا مباشرًا لصحة وحياة البشر والحيوانات. الحقيقة هي أن ELISA لديها العديد من الخيارات (غير تنافسية وتنافسية - مباشرة وغير مباشرة) ، كل منها يحل مشكلته الخاصة ، وبالتالي يسمح بالبحث المستهدف.

للكشف عن الغلوبولين المناعي من فئة أو أخرى ، يتم استخدام لوحة (قرص) بوليسترين تقليدية مكونة من 96 بئراً ، في الآبار التي تتركز فيها البروتينات المؤتلفة الممتزّة في المرحلة الصلبة. الأجسام المضادة أو المستضدات التي دخلت البئر مع مصل الدم تجد شيئًا "مألوفًا" وتشكل معقدًا معه (AG - AT) ، والذي يثبت بواسطة الإنزيم المتقارن ، سوف يظهر كتغير في لون البئر عند قراءة النتائج.

يتم إجراء المقايسة المناعية للإنزيم على أنظمة اختبار ذات خصوصية معينة ، يتم تصنيعها في مختبرات خاصةواستكملت بجميع مكونات التفاعل الضرورية. يمكن إجراء الدراسات باستخدام غسالات ("غسالات") وقراءة أجهزة قياس الطيف الضوئي ، حيث بالنسبة للجزء الاكبرالعمل اليدوي المتضمن. في الأجهزة الأوتوماتيكية بالكامل ، فإن تحرير مساعد المختبر من التقطير الرتيب والغسيل والمهام الروتينية الأخرى ، بالطبع ، يكون أسرع وأكثر ملاءمة للعمل ، ولكن لا تستطيع جميع المعامل تحمل مثل هذه الرفاهية والاستمرار في العمل بالطريقة القديمة - على الأجهزة شبه الأوتوماتيكية.

يعتبر تفسير نتائج ELISA ضمن اختصاص طبيب التشخيص المختبري ، في حين أن الخاصية الكامنة في جميع التفاعلات الكيميائية المناعية تقريبًا لإعطاء إجابات كاذبة أو سلبية كاذبة تؤخذ في الاعتبار بالضرورة.

فيديو: المقايسة المناعية للإنزيم الحديث

نتائج ELISA على مثال مرض الزهري

ELISA مناسب للكشف عن جميع الأشكال، وبالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدامه في دراسات الفرز. لاستخدام التحليل الدم الوريديأخذ المريض على معدة فارغة. في العمل ، يتم استخدام لوحات ذات خصوصية معينة (فئات AT A ، M ، G) أو إجمالي الأجسام المضادة.

بالنظر إلى أن الأجسام المضادة في مرض الزهري يتم إنتاجها في تسلسل محدد ، يمكن لـ ELISA الإجابة بسهولة على السؤال عن وقت حدوث العدوى وفي أي مرحلة تكون العملية ، ويمكن تقديم فك تشفير النتائج التي تم الحصول عليها بالشكل التالي:

• يشير IgM إلى مدة العملية المعدية (قد تظهر أثناء تفاقم الأمراض الالتهابية المزمنة) ؛
• يذكر IgA أن العدوى حدثت منذ أكثر من شهر ؛
• يشير IgG إلى أن العدوى في أوجها أو علاجها حديثًا ، والذي يمكن اكتشافه بسهولة عند جمع سوابق الدم.

عند اختبار مرض الزهري ، فإن الآبار السلبية (والتحكم السلبي) ستظل عديمة اللون ، بينما الإيجابية (مثل التحكم الإيجابي) ستظهر لونًا أصفر ساطعًا بسبب تغير لون الكروموجين المضاف أثناء الاختبار. ومع ذلك ، فإن شدة اللون لا تتطابق دائمًا مع عنصر التحكم ، أي أنه قد يكون شاحبًا قليلاً أو أصفر قليلاً. هذه نتائج مشكوك فيها ، والتي ، كقاعدة عامة ، تخضع لإعادة الفحص مع مراعاة إلزامية للمؤشرات الكمية التي تم الحصول عليها على مقياس الطيف الضوئي ، ولكن بشكل عام ، يتناسب اللون بشكل مباشر مع عدد المجمعات المناعية (المستضدات والأجسام المضادة المرتبطة ببعضها البعض).

أكثر المقايسات المناعية للإنزيم إثارة - ELISA لفيروس نقص المناعة البشرية

التحليل ، ربما أكثر من غيره ، يهم مجموعة واسعة من السكان ، لأنه ليس من الممكن حتى الآن القول على وجه اليقين أن الكثيرين مشاكل اجتماعية(الدعارة ، إدمان المخدرات ، إلخ). لسوء الحظ ، لا يؤثر فيروس نقص المناعة البشرية على هذه الشرائح من المجتمع البشري فحسب ، بل يمكن أن تصاب به ظروف مختلفةلا علاقة لها بالاختلاط الجنسي أو تعاطي المخدرات. ولكن إذا كانت هناك حاجة لإجراء اختبار فيروس نقص المناعة البشرية ، فلا داعي للخوف من أن يكتشف كل من حولك أمر زيارة مثل هذا المختبر. الآن الأشخاص المصابون بفيروس نقص المناعة البشريةمحمية بموجب القانون ، ويمكن للمشككين اللجوء إلى مكاتب مجهولة حيث يمكنك حل المشكلة دون خوف من الدعاية والإدانة.

طريقة ELISA المستخدمة في التشخيص عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، يشير إلى الدراسات المعيارية الأولية ، والتي ، مع ذلك ، تتطلب شروطا خاصة ، لأن الموضوع حساس للغاية.

من المنطقي إجراء ELISA لفيروس نقص المناعة البشرية بعد الاتصال الجنسي ، ونقل الدم ، والإجراءات الطبية الأخرى التي تنطوي على العدوى ، وفي نهاية فترة الحضانة ("نافذة سلبيّة") ، ولكن يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن هذه الفترة الزمنية ليست ثابتة. يمكن أن تنتهي في 14-30 يومًا ، أو يمكن أن تستمر حتى ستة أشهر ، لذلك يعتبر متوسط ​​القيمة فترة من 45 إلى 90 يومًا. يتم التبرع بالدم لفيروس نقص المناعة البشرية بنفس الطريقة المتبعة في حالات العدوى الأخرى - من الوريد على معدة فارغة. ستكون النتائج جاهزة بناءً على تراكم المواد في المختبر وعبء العمل (من 2 إلى 10 أيام) ، على الرغم من أن معظم المختبرات تقدم استجابة في نفس اليوم أو في اليوم التالي.

ما الذي يمكن توقعه من نتائج فيروس نقص المناعة البشرية؟

ELISA لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية يكتشف الأجسام المضادة لنوعين من الفيروس: HIV-1 (أكثر شيوعًا في روسيا ودول أوروبية وآسيوية أخرى) وفيروس HIV-2 (أكثر شيوعًا في غرب إفريقيا).

تتمثل مهمة HIV ELISA في البحث عن الأجسام المضادة من الفئة G ، والتي يتم اكتشافها في جميع أنظمة الاختبار ، ولكن في فترة لاحقة ، والأجسام المضادة من الفئة A و M ، التي تم اكتشافها في مجموعات اختبار المؤتلف من الجيل الجديد ، مما يجعل من الممكن اكتشاف الأجسام المضادة على الأكثر المراحل الأولى (فترة الحضانة- نافذة سلبيّة). يمكن توقع الإجابات التالية من ELISA:

1. النتيجة الإيجابية الأولية: يخضع الدم لإعادة الفحص على نظام اختبار من نفس النوع ، ولكن إذا أمكن ، من سلسلة مختلفة ومن قبل شخص آخر (مساعد مختبر) ؛
2. تكرار (+) يتضمن أخذ عينات دم جديدة من مريض بدراسة مشابهة للتحليل الأولي ؛
3. تخضع النتيجة الإيجابية التالية لتحليل مرجعي ، والذي يستخدم مجموعات اختبار محددة للغاية (2-3 قطع) ؛
4. يتم إرسال نتيجة إيجابية في كلا النظامين (أو ثلاثة) من أجل التخمير المناعي (نفس ELISA ، ولكن يتم إجراؤها في بشكل فرديعلى مجموعات اختبار ذات خصوصية عالية بشكل خاص).

الخلاصة حول عدوى فيروس نقص المناعة البشريةمأخوذة فقط على أساس التكتل المناعي. يتم إجراء محادثة مع الشخص المصاب في سرية تامة. الكشف عن الأسرار الطبية في روسيا ، وكذلك في البلدان الأخرى ، يخضع لعقوبة جنائية.

اختبارات الكلاميديا ​​والفيروس المضخم للخلايا الإنزيم المناعياكتسبت أيضًا شعبية خاصة ، نظرًا لأنها تسمح لك بتحديد وقت الإصابة ومرحلة المرض وفعالية التدابير العلاجية.

أثناء التقديم ، من الممكن أيضًا ملاحظة ظهور الأجسام المضادة من مختلف الفئات.في مراحل مختلفة حالة مرضيةبسبب عامل معدي:

• يمكن اكتشاف IgM في وقت مبكر يصل إلى سبعة أيام بعد الإصابة ؛
• يشير IgA إلى أن العدوى تعيش في الجسم منذ أكثر من شهر ؛
• يؤكد IgG تشخيص الكلاميديا ​​، ويساعد في مراقبة العلاج وتحديد فعاليته. تجدر الإشارة إلى أن الأجسام المضادة من الفئة G تبقى وتنتشر في الجسم بغض النظر عن مدة المرض ، لذلك ، من أجل التفسير الصحيح للتحليل ، يجب مراعاة القيم المرجعية (المعايير) ، والتي ، بالمناسبة ، تختلف لكل CDL: مع مراعاة العلامة التجارية لنظام الاختبار وخصوصية الكواشف المدرجة في المجموعة. يتم إدخال القيم المعيارية في النموذج بجوار نتيجة ELISA.

أما هنا فهو مختلف قليلاً:تظهر الأجسام المضادة من الفئة M في حوالي شهر ونصف ، أي أن النتيجة الإيجابية (IgM +) تصبح في مرحلة العدوى الأولية أو أثناء إعادة تنشيط عدوى كامنة وتبقى كذلك من 4 أشهر إلى ستة أشهر.

يعد وجود الأجسام المضادة من الفئة G سمة مميزة لبداية المرحلة الأولية العدوى الحادةأو الإصابة مرة أخرى. يشير التحليل إلى وجود الفيروس ، لكنه لا يوفر معلومات عن مرحلة العملية المعدية. وفي الوقت نفسه ، فإن تحديد معيار عيار IgG يسبب أيضًا صعوبات ، لأنه يعتمد كليًا على الحالة المناعية لشخص معين ، والتي ، مع ذلك ، يتم تحديدها من خلال الكشف عن الغلوبولين المناعي من الفئة G. نظرًا لسلوك الأجسام المضادة ، عند تشخيص CMVI ، يصبح من الضروري تقييم قدرة الأجسام المضادة من الفئة G على التفاعل مع CMV من أجل "تحييدها" (AT avidity). على المرحلة الأوليةترتبط أمراض الغلوبولين المناعي G بشكل سيء جدًا بمضادات الفيروس (انخفاض الشغف) وعندها فقط تبدأ في إظهار النشاط ، لذلك يمكننا التحدث عن زيادة في شغف الأجسام المضادة.

يمكننا التحدث عن مزايا المقايسة المناعية للإنزيم لفترة طويلة ، لأن هذه الطريقة تمكنت من حل العديد من المشكلات التشخيصية باستخدام الدم الوريدي فقط. ليست هناك حاجة لفترات الانتظار الطويلة والقلق ومشاكل أخذ المواد للبحث. بالإضافة إلى ذلك ، تستمر أنظمة اختبار ELISA في التحسن واليوم الذي سيعطي فيه الاختبار موثوقية بنسبة 100٪ للنتيجة ليس بعيدًا.

فيديو: فيلم تعليمي لجامعة موسكو الطبية الحكومية. سيتشينوف على أساسيات إليسا

من أجل تحديد مستوى محتوى هذه بيولوجيا المواد الفعالة، مثل المجمعات المناعية ، يلزم إجراء دراسة معملية خاصة. في حالة الاشتباه في وجود مرض دموي أو معدي أو أمراض المناعة الذاتية ، يصف المتخصصون اختبار الدم لـ ELISA. في سياق المقال ، سننظر في ماهيته ، وكيفية التحضير له ، وما يعرضه وكيفية فكه بنفسك.

أي نوع من الدراسة هذه - فحص دم لـ ELISA؟ يشير الاختصار إلى المقايسة المناعية للإنزيم ، والتي تحدد المحتوى الكمي والنوعي لمختلف المواد النشطة بيولوجيًا ، وكذلك الأجسام المضادة ومولدات المضادات في المواد البيولوجية.

ما يستخدم في الإنزيم المناعي:

• السائل النخاعي؛
• مخاط مجرى البول ، قناة عنق الرحم.
• السائل الذي يحيط بالجنين؛
• محتويات الجسم الزجاجي.

يوصف الإنزيم المناعي لغرض تشخيص الأمراض المنقولة جنسياً ، والعمليات المعدية والأورام ، وردود الفعل التحسسية ، والاضطرابات في عمل الغدد الصماء و الجهاز التناسليوأمراض المناعة الذاتية ونقص المناعة ، وكذلك لتقييم مخاطر الإصابة ببعض الكلى.

يوصف اختبار الدم لـ ELISA أثناء الحمل لغرض الكشف المبكر ، واضطرابات النمو في المراحل الأولية والتحكم في دينامياتها. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح لك تحليل ELISA بالتحكم في مستوى الأجسام المضادة التي يمكن أن تثير تطور اضطرابات عصبية شديدة لدى الطفل ، وبالتالي منع تطور المضاعفات ليس فقط أثناء الحمل ، ولكن أيضًا أثناء الولادة.

فهو يجعل من الممكن الاستجابة مقدمًا للمشكلات التي تم تحديدها وتحسين صحة الأم نفسها وطفلها بشكل ملحوظ.

تشمل فوائد ELISA في الدم ما يلي:

• درجة حساسية عالية (تصل إلى 90٪) ؛
• إمكانية التشخيص المبكر ، مع تحديد مرحلة المرض في وقت واحد ؛
• التكلفة المنخفضة للكواشف ، وبالتالي توافرها ؛
• الحد الأدنى من المواد للبحث ؛
• الحد الأدنى من شروط الاستلام ؛
• إمكانية تخزين الكواشف على المدى الطويل ؛
• القدرة على التحكم في ديناميات تطور العملية المرضية.

سلبيات المقايسة المناعية للإنزيم:

• من المستحيل تحديد العامل المسبب للمرض ، في المختبر لا يتلقون سوى استجابة مناعية له
• إمكانية الحصول على نتيجة خاطئة (في حالات نادرة جدًا ، خاصة خلال فترة الحمل).

تحضير

يعتمد مبدأ هذا النوع من اختبارات الدم على تكوين أجسام مضادة محددة في جسم الإنسان عند دخول المستضدات إليه ، أي العوامل الأجنبية التي تسبب تطور مرض معين. نتيجة لتفاعلهم ، تتشكل مجمعات "مستضد - جسم مضاد" ، والتي تخضع للبحث في تنفيذ المقايسة المناعية الإنزيمية.

في هذا الصدد ، من أجل عدم التأثير على هذه المجمعات ، وبالتالي ، موثوقية النتائج التي تم الحصول عليها ، يتطلب فحص الدم والمواد البيولوجية الأخرى لـ ELISA بعض التحضير.

أيضًا ، قبل 14 يومًا من الفحص المقترح ، يتم تعليق العلاج المحدد وإيقاف استخدام الأدوية المضادة للبكتيريا والفيروسات.

يؤخذ الدم من أجل ELISA من الوريد. مباشرة قبل أخذ عينات الدم ، حد تمرين جسديوتجنب التدخين وشرب الكحول.

هناك عدة تقنيات وطرق لإجراء المقايسة المناعية للإنزيم: الطريقة المباشرة وغير المباشرة ، الطريقة التنافسية وطريقة الحجب.

أساس فحص الدم (أي مادة بيولوجية أخرى) على ELISA هو خوارزمية تتكون من تنفيذ تفاعلين - مناعي وأنزيمي.

خلال الأول ، ترتبط العوامل المرضية بالعناصر الواقية لخلايا المادة البيولوجية المأخوذة للدراسة. تشكلت مجمع المناعةمستضد. تبدو هكذا. توجد المستضدات على سطح جميع الخلايا تمامًا.

عندما تدخل الخلايا الأجنبية الجسم ، يتم التقاطها الخلايا المناعية(التي توجد الأجسام المضادة على أسطحها) ، والتي تقارن بيانات المستضد من سطح الخلايا التي وصلت حديثًا بالمعلومات المخزنة في "الذاكرة" الخاصة بها. في حالة وجود تناقض بين هذه البيانات ، يتم تضمين الوظائف الوقائية للجسم ، والتي تتكون في تكوين مركب مناعي.

بعد ذلك ، يتم إجراء تفاعل إنزيمي يصور نتائج التفاعل السابق. يعتمد مبدأها على تحويل المادة من واحدة إلى أخرى. لكل نوع من أنواع ELISA التي تتشكل أثناء التفاعل المناعي للمادة ، يوجد إنزيم معين ، يتم استخدام معالجته لتحديد تركيز عامل غريب (حسب كثافة تلطيخ المحلول).

فك التشفير

بفضل فحص الدم لـ ELISA ، يحدد مساعدو المختبر A و G و M. النتيجة الإيجابية في دراسة الدم (المواد الخام البيولوجية الأخرى) لـ ELISA تجعل من الممكن ليس فقط إجراء التشخيص ، ولكن أيضًا مرحلة المرض ، وكذلك طبيعة مساره (الحاد أو المزمن).

تتشكل هذه الغلوبولين المناعي في وجود عملية مرضية في جسم المريض في فترات مختلفة من المرض:

• الغلوبولين المناعي M ، IgM- تتشكل بعد خمسة أيام من ظهور المرض وتبقى في الدم لمدة 1.5 شهر وبعدها تختفي. يشير اكتشاف IgM إلى وجود عملية مرضية أولية حادة في الجسم والحاجة إلى تدخل علاجي محسن.
• الغلوبولين المناعي G ، IgG- تحدث بعد أربعة أسابيع من الإصابة ويمكن الكشف عن وجودها في الجسم لعدة أشهر. يشير الكشف عن IgG إلى وجود مرض ماضٍ لدى الشخص في سوابق المريض. قد تشير الزيادة في محتواها أيضًا إلى إعادة الإصابة.
• الغلوبولين المناعي A، IgA- تظهر وقت الإصابة وتبقى في الجسم لمدة أربعة أسابيع. يشير الانخفاض في محتواها إلى بداية التعافي. يشير الظهور في التحليلات مرة أخرى بعد خضوع الشخص لدورة علاجية وتعافيها ، إلى انتقال المرض إلى شكل مزمن. يشير الكشف المتزامن لـ IgA و IgG في نتائج ELISA أيضًا إلى وجود عملية مزمنة في الجسم.

وتجدر الإشارة أيضًا إلى أن التواجد المتزامن في فحوصات IgGويشير IgM إلى أن العملية المزمنة قد ساءت ويحتاج المريض لبدء العلاج. إذا لم يتم اكتشاف أي من الغلوبولين المناعي أثناء الفحص ، فهذا يعني عدم وجود استجابة مناعية.