Реакция торможения гемагглютинации в вирусологии. Реакция торможения гемагглютинации (ртга)

В основе РГА лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов. В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензию хорионаллантоисных оболочек куринных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур или органов животных, зараженных вирусами, нативный инфекционный материал. РГА не является серологической, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки и используется для выбора рабочего разведения антигена для постановки РТГА или наличия антигена (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции используются эритроциты животных, птиц, человека I (0) группы крови.

Для постановки ориентировочной РГА на предметное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов и каплю испытуемого материала, тщательно смешивают. При положительном результате через 1-2 минуты макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов.

Для постановки РГА в развернутом ряду в лунках полистероловых планшетов готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на физиологическом растворе в объёме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25 - 1% взвеси эритроцитов. Результаты учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов, покрывающей дно пробирки (зонтик), реакцию с просветами в пленке отмечают тремя плюсами, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями из склеившихся эритроцитов обозначают двумя плюсами, хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов соответствует одному плюсу. Резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля показывает отсутствие агглютинации. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса.

При положительном результате РГА исследование продолжают, определяя тип выделенного вируса с помощью реакции торможения гемагглютинации типоспецифическими сыворотками.

РТГА основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфичными антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. При ориентировочном типировании вирусов используют капельный метод на стекле. Для окончательного установления типовой принадлежности выделенного вируса и титрования антител в сыворотках ставят развернутую РТГА в пробирках или в лунках. С этой целью готовят двухкратные разведения сывороток на физиологическом растворе и разливают по 0,25 мл. К разведениям сыворотки прибавляют по одной капле материала, содержащего вирус и по одной капле 1% взвеси эритроцитов.

При использовании РТГА для определения типа вируса, используют типоспецифические сыворотки, которые добавляют к равному объему рабочего разведения антигена. Типовую принадлежность выделенного вируса устанавливают по специфической иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр антител к этому вирусу.

РГА и РТГА широко применяется для диагностики вирусных инфекций (клещевой энцефалит, грипп и др.) с целью обнаружения специфических антител и для идентификации многих вирусов по их антигенам.

Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус, путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка расценивается как признак взаимодействия антител сыворотки и вируса.

Но антитела с антигенами взаимодействуют в строго определенных количественных соотношениях. Поэтому, для того чтобы определенное количество вируса было лишено гемагглютинирующей способности, требуется определенный минимум антител, а так как один из компонентов РТГА всегда неизвестен, приходится реакцию ставить в ряду пробирок с различными дозами антител и одинаковыми дозами вируса или наоборот. Это достигается тем, что берут или разные разведения сыворотки и одно и то же разведение вируса, или разные разведения вируса и одно и то же разведение сыворотки.

РТГА позволяет решать следующие задачи: определять титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень антигенного родства двух вирусов.

Достоинства РТГА: простота техники, быстрота, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевизна. Недостаток: РТГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Принцип титрования антител в РТГА состоит в следующем:

– готовят ряд последовательных (обычно 2-кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаще по 0,25 или 0,2 мл);

– к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ;

– смеси выдерживают определенное время при определенной температуре (для вируса ньюкаслской болезни 40–60 мин при комнатной температуре);

– ко всем смесям добавляют равные объемы 1%-ной суспензии отмытых эритроцитов;

– после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах.

В реакции предусматриваются контроли сыворотки, вируса и эритроцитов.

То наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию, принимается за показатель титра антител в этой сыворотке.

Использование в вирусологии реакции гемадсорбции.

РГАд. Гемадсорбция – соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток – впервые была обнаружена Фогелем и Щелоковым (1957) на культуре ткани, инфицированной вирусом гриппа. В основе этого явления лежит родство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицированных клетках.

Методика РГАд состоит в следующем. На 3–4-й день после инфицирования клеток берут две пробирки с одинаковой культурой клеток, из которых одна заражена вируссодержащим материалом, а вторая контрольная. Из обеих пробирок сливают культуральную жидкость и вносят в обе по 2–3 капли 0,5%-ной суспензии отмытых эритроцитов. Обе пробирки оставляют на 5–10 мин так, чтобы эритроциты были на поверхности клеток (кладут горизонтально на стол), а затем слегка споласкивают физраствором и исследуют под микроскопом (малое увеличение). В контрольной пробирке эритроциты полностью удаляются с физраствором, а некоторые из оставшихся плывут вместе с жидкостью. Если в зараженной пробирке эритроциты не удалились с физраствором и не плывут, а прикреплены к поверхности клеток, следует считать РГАд положительной.

В зависимости от вируса и вида клеток расположение эритроцитов может быть трояким:

– эритроциты адсорбированы только по периферии клеточного пласта в виде «ожерелья» (вирус африканской чумы свиней);

– эритроциты расположены на слое клеток очагами или скоплениями (вирус гриппа);

– эритроциты расположены на слое клеток диффузно (вирус парагриппа).

Каждый вирус способен адсорбировать эритроциты крови животных определенных видов.

Серологическая диагностика вирусных болезней по приросту титра антител в парных сыворотках крови.

Реакция гемагглютинации (РГА) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА), механизм, компоненты и применение реакций.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.

Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1: 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению.

Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки

Основные компоненты РП:

А) растворимый антиген,

Б) Специфические антитела (сыворотка)

(РТГА) — метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к нему сыворотки крови.
основана на блокаде, подавлении ан-тигенов вирусов антителами иммунной сы-воротки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты.

РТГА применяют для диагностики мно-гих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещево-го энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.
Механизм. Типирование вируса проводят в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса А с антигенами H0N1, H1N1, Н2N2, H3N2 и др.

могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов.

Различают прямую и непрямую гемагглютинацию.
При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов.
В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами.

Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки.

Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела.

Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов.

Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1: 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами.

После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум.

Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

Реакция торможения гемагглютинации - серологическая реакция, основанная на способности антител предотвращать агглютинацию эритроцитов гемагглютинирующими видами вирусов (аденовирусами, арбовирусами, некоторыми энтеровирусами, вирусами гриппа и парагриппа, кори, реовирусами).

Специфические антивирусные антитела взаимодействуют с поверхностными молекулами гемагглютининов вирионов этих вирусов и блокируют их связывание с комплементарными им молекулами мембраны эритроцитов.

В последнее время реакция широко используется в лабораториях клинической вирусологии для определения титров специфических антител к тем или иным вирусам, а также для серологической идентификации и типирования изолятов вирусов из клинического материала от больных.

Используют несколько ограничено в силу наличия в сыворотке крови людей неспецифических ингибиторов вирусов, а также естественных антител - агглютининов.

Реакция нейтрализации - реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

РТГА применяется:
-для серотипирования вирусов;
-для серодиагностики инфекций.
Выделяют два способа постановки:
— капельный способ на стекле (ориентировочная реакция), применяется для серо копирования вирусов;
— развернутый в пробирках.

Механизм .

У некоторых вирусов (например, гриппа) есть гемагглютинин, вызывающий агглютинацию эритроцитов различных животных, в зависимости от вида вируса.

При наличии в сыворотке антител - антигемагглютининов наблюдаются ингибирования активности вирусов.
РТГА.
Цель: серотипирование вируса гриппа А

Компоненты:
1. Исследуемый материал - аллантоисная жидкость куриного эмбриона,
2. Диагностические противогриппозные типоспецифические сыворотки,
3. 5 % взвесь куриных эритроцитов.
4.

Физиологический раствор.

Реакция ставится на стекле капельным способом. На стекло наносят по 1 капле диагностических сывороток и исследуемого материала, перемешивают, затем добавляют 1 каплю взвеси эритроцитов. При положительной реакции наблюдается гомогенное покраснение, а при отрицательной выпадение хлопьев красного цвета (гемагглютинация).

Предыдущая31323334353637383940414243444546Следующая

Характеристика вирусов гриппа. Эпидемиология и диагностика гриппа. Использование РТГА для серотипирования вирусов гриппа. Препараты для специфической профилактики и лечения.

Грипп или инфлюэнца — острое инфекционное заболевание, характеризующееся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей, лихорадкой, общей интоксикацией, нарушением деятельности сердечно-сосудистой и нервной систем.

Грипп отличается склонностью к эпидемическому и пандемическому распространению благодаря высокой контагиозности и изменчивости возбудителя.

Характеристика возбудителей. Возбудители — вирусы гриппа относится к сем. Orthomyxoviridae, родам Influenzavirus А, В и Influenzavirus С. Вирусы гриппа — это РНК- вирусы. Вирус гриппа типа А был выделен в 1933 г. У. Смитом, К. Эндрюсом, П. Лейдлоу. В 1940 г. Т.

Применение метода гемагглютинации в вирусологии.

Френсис и Р. Меджилл выделили вирусы гриппа типа В, в 1949 г. Р. Тейлор — типа С. В России первые вирусы гриппа были выделены в 1936 г. А. А. Смородинцевым и отнесены к типу А. Морфология. Вирусы гриппа имеют сферическую форму (форму шара) — 80 — 120 нм, реже имеют нитевидную форму. Состоят из: 1) сердцевина — нуклеокапсид спирального типа симметрии (однонитчатая линейная «-» -нить РНК + белковый капсид); 2) базальная мембрана — наружная липопротеидная оболочка — суперкапсид.

На поверхности оболочки находятся гликопротеиды (в виде шипов и ворсинок) 2-х типов: 1) гемагглютинин — способствует прикреплению к рецепторам клетки; 2) нейраминидаза - способствует освобождению вируса из клетки. Культивирование. Для культивирования используют куриные эмбрионы, первично трипсинизированные культуры клеток, иногда лабораторных животных.

Самой удобной моделью являются куриные эмбрионы 10-12 -дневного возраста. Она позволяет получить большие количества вируса, что необходимо при производстве вакцин и бакпрепаратов.

Заражение производят в аллонтоисную полость, на хорион-аллонтоисную оболочку, в амниотическую полость, в амнион. Наличие вируса в курином эмбрионе выявляют в реакции гемагглютинации. Антигенная структура. Вирусы имеют внутренний антиген — S и поверхностные антигены: НА-гемагглютинин и NA-нейраминидаза. S-антиген — группоспецифический, общий для целого типа, по этому антигену вирусы гриппа делятся на типы А, В и С. Это комплементсвязывающий, стабильный (неизменяющийся) антиген.

НА и NA-антигены — это специфические антигены. НА-антиген вызывает образование вируснейтрализующих антител и склеивание эритроцитов.

NA-антиген вызывает образование антител, частично нейтрализующих вирусы.

Вирус типа В менее изменчив, а тип С отличается высокой стабильностью.

Токсические свойства. Токсическое действие вируса на организм (головная боль, мышечные боли, температура, катаральные явления) обусловлено белками вируса (самой вирусной частицей). Это действие строго специфично и нейтрализуется только иммунной сывороткой соответствующего типа или подтипа или сывороткой переболевших. Резистентность. Вирусы гриппа чувствительны к действию УФ-лучей, дез.веществам (формалину, спирту, фенолу, хлорамину) и к жирорастворителям.

В жидкой среде погибают при, температуре 50 — 60°С в течение нескольких минут. При комнатной температуре в воздухе вирусы сохраняют инфекционные свойства несколько часов. Долго сохраняются в высушенном виде, а в замороженном состоянии (- 70°С) не только долго сохраняются, но и не теряют вирулентности.

Восприимчивость животных. В естественных условиях вирусы типа А поражают человека и животных (болеют лошади, свиньи), а вирусы типов В и С — только человека. Среди лабораторных животных к вирусам чувствительны белые мыши, африканские хорьки, сирийские хомяки, обезьяны.

Заболевание у животных характеризуется поражением легких, лихорадочным состоянием и может закончиться гибелью животных. Эпидемиология заболевания. Источник инфекции — больной человек с клинически выраженной или бессимптомной формой. Больной человек выделяет вирус в окружающую среду при кашле, разговоре, чиханье с каплями слюны, слизи, мокроты уже в инкубационный период.

Больной становится заразным за 24 часа до появления основных симптомов и представляет эпидемическую опасность в течение 48 часов после их исчезновения.

Механизм передачи — аэрогенный. Путь передачи — воздушно-капельный. Восприимчивость людей к гриппу очень высокая. Болеют все возрастные группы, преимущественно в зимнее время. Наиболее восприимчивы дети и лица преклонного возраста. В названии заболевания отражены особенности эпидемиологии: грипп от франц. gripper — хватать, инфлюэнца — от итал. Influenza di freddo — влияние холода.

Из всех острых респираторных заболеваний грипп — наиболее массовое и тяжелое заболевание. Пандемии и эпидемии гриппа охватывают до 30- 50% и более населения земного шара, нанося огромный ущерб здоровью и экономике стран. Первые описания эпидемий гриппа относятся к 12-14 в. Возникновение пандемий и крупных эпидемий вызывает вирус гриппа типа А, что обусловлено высокой изменчивостью вируса и связано с появлением нового подтипа в результате шифта антигенов.

Между пандемиями каждые 1,5-2 года возникают эпидемические вспышки, что связано с антигенным дрейфом вирусов. В 1918 г. пандемию гриппа «испанки» (заболело 1,5 млрд. чел., умерло 20 млн. чел.) вызвал вирус гриппа типа А1 Первично зарегистрированная в Испании, эта пандемия охватила практически все население Земли; заболевание характеризовалось развитием исключительно тяжелых геморрагических пневмоний с рекордным показателем смертности (до 1% от всех случаев).

В 1957 г. «азиатскую» пандемию (заболело 2 млрд. чел.) вызвал новый подтип — подтип А2. В 1968 г. «гонконгская» пандемия (заболел 1 млрд. чел.) была вызвана вновь возникшим подтипом — подтипом А3. Как правило, новый вариант вируса вытесняет из человеческой популяции раннее циркулировавшую разновидность.

Но в 1977 г. после 20-летнего перерыва неожиданно «возвратился» тип А1, что привело к возникновению крупной эпидемии. Следовательно, вытесненные варианты вируса гриппа сохраняются и через определенные промежутки времени могут снова вызвать эпидемию. Вирус типа В вызывает локальные эпидемии, а тип С эпидемий не вызывает. Патогенез и клиника заболевания. Входные ворота — верхние дыхательные пути. Вирус внедряется в эпителиальные клетки слизистой оболочки и размножается в них.

Воздействие вируса на эпителиальные клетки вызывает их некроз и слущивание (отторжение) эпителия, в результате чего слизистая оболочка становится проницаемой для вирусов и бактерий. Они проникают в кровь и распространяются по всему организму» Вирусемия сопровождается множественными поражениями эндотелия капилляров с повышением их проницаемости.

В тяжелых случаях наблюдаются обширные кровоизлияния в легких, миокарде, паренхиматозных органах. Продукты распада поврежденных клеток и вирусные белки оказывают токсическое действие на различные органы и системы органов. Токсины вируса сильно угнетают ЦНС, и, хотя процесс длится недолго(3 — 5 дней), больной человек еще долго остается ослабленным и к ослабленному организму присоединяется какая-либо вторичная инфекция и возникают ос-ложнения: гриппозные пневмонии, острый отек легких, поражение почек, сердца, бронхов.

Частое осложнение гриппа — бактериальные пневмонии (стрептококки группы В). Во время пандемии «испанки» люди умирали, в основном, от вторичных бактериальных пневмоний.

В патогенезе гриппа имеет значение не только интоксикация, но и аллергизация, а также нарушение функциональных свойств иммуннокомпетентных клеток с развитием иммунодефицита. Инкубационный период — несколько часов — 1-3 суток. Характерно острое начало, повышение температуры до 37,5 — 38°С, общая интоксикация, выражающаяся в недомогании, головной боли, боли в глазных яблоках, воспалительных процессах дыхательных путей различной степени тяжести (риниты, ларингиты, трахеиты, фарингиты).

Лихорадочное состояние при гриппе без осложнений длится 5-6 дней. Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется типоспецифический и штаммоспецифический иммунитет, который обеспечивается специфическими и неспецифическими клеточными и гуморальными факторами. Большое значение имеют антитела Ig А. Перекрестного иммунитете не развивается, после перенесения гриппа типа А1, можно заболеть гриппом типа А2 и т.д. После вируса типа иммунитет -1-2 года, после вируса типа В — 3 - 5 лет.

Пассивный естественный иммунитет — у детей до 8 — 11 мес. Из-за высокой антигенной изменчивости вируса выздоровление не приводит к развитию стойкой невосприимчивости к повторным заражениям.

Лабораторная диагностика. Исследуемый материал: мазки-отпечатки со слизистой носовой полости, отделяемое носоглотки, кусочки легких, мозга при летальных исходах.

Методы диагностики: 1) метод циториноскопии — обнаружение внутриклеточных включений, специфических для вируса — при окраске пиоктанином под микроскопом видны ярко-красные включения вируса гриппа в клетках ресничного эпителия; 2) вирусологический метод — выделение вируса гриппа из организма человека путем заражения куриных эмбрионов смывом из носоглотки больного; индикацию (присутствие) вируса проводят при помощи РГА (вирусы гриппа агглютинируют эритроциты человека и различных животных), идентификацию вируса проводят поэтапно: тип определяют в РСК, подтип гемагглютинина — в РТГА, а подтип нейраминидазы — в реакции ингибирования активности фермента; 3) серологический метод — обнаружение нарастания титра (в 4 раза) специфических антител в сыворотке крови больного с помощью РСК, РТГА, РН в культуре клеток, реакции преципитации в геле, ИФА; 4) биологический метод — интраназальное заражение мышей — введение материала в легкие под эфирным наркозом; мыши погибают через 2 - 3 дня в результате пневмонии; 5)экспересс-диагностика — выявление вирусного антигена с помощью РИФ.

Лечение и профилактика.

Для профилактики и лечения в первые дни болезни применяют человеческий лейкоцитарный интерферон (интраназально). В лечебных целях используют противовирусные препараты — ремантадин (грипп типа А), адапромин, виразол и иммуномодулирующие препараты — дибазол, продигиозан, левомизол.

При тяжелом течении гриппа, особенно у детей, применяют донорский противогриппозный иммуноглобулин, а также препараты — ингибиторы клеточных протеаз (гордокс, контрикал, аминокапроновая кислота).

Спецпрофилактика. Используются перечисленные противовирусные препараты и иммуномодуляторы, а также вакцины — живые и инактивированные: 1) живые моновакцины для перорального применения – аттенуированные штаммы вирусов, циркулирующих в настоящее время (А1, А3 и В); проявляют наибольшую иммуногенность; 2) цельновирионные вакцины из вирулентных штаммов, инактивированных формальдегидом или УФ-лучами; 3) субъединичные гриппозные вакцины только из поверхностных антигенов — НА и NA-антигенов (обладают минимальной реактогенностью).

Для получения вакцин вирусы культивируют в куриных эмбрионах и на культуре клеток куриных эмбрионов.

При введении вакцин формируется местный и гуморальный иммунитет. Вакцинацию осуществляют в периоды наибольшего риска развития эпидемий. Она в большей степени показана лицам младшего и преклонного возраста. Применение убитых вакцин требует ежегодной ревакцинации; их эффективность не превышает 60 — 70%.

Т.к. часто наблюдаются антигенные вариации возбудителя, то набор антигенов соответствующего вируса для иммунизации может быть определен только после начала вспышки заболевания.

Билет 15.

Реакция гемагглютинации (РГА).

В лаборатории пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами).

Реакцию широко используют для определения групп крови.

Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не

антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита — эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Реакцию проводят в пробирках или на специальных пластинках с лунками.

Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объёмом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят на 30 минут в термостат, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 минут.

Учёт результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями («зонтик»), покрывающий всё дно лунки.

Реакция торможения гемагглютинации

При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями («пуговку»). Такой же осадок должен быть в контроле.

Интенсивность реакции выражают знаками «+». Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.

Реакция торможения гемагглютинации

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.

е. тормозят реакцию гемагглютинации. Эта реакция позволяет определить вид и тип вирусов.

Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки смешивают с равным объёмом материала, содержащего вирус. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 минут, после чего добавляют по 0,5 мл’1-2% взвеси эритроцитов.

Учёт результатов. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» — нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» — вирус вызвал агглютинацию эритроцитов.

Если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» — сыворотка нейтрализовала вирус.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену.

Постановка реакции.

Сыворотку прогревают 30 минут при 56 °С, разводят последовательно в соотношении 1:10 — 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитов с адсорбированными на них антигенами.

Контроли: взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с заведомо иммунной сывороткой, взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой.

В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем её не должно быть.

Контрольные вопросы.

1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?

2. Произойдет ли реакция агглютинации эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку?

Как называется реакция, выявляющая этот феномен?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №12.

Реакция связывания комплемента.

Реакция связывания комплимента (РСК) основана на том, что’ специфический комплекс антиген — антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов ив серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РКС-сложная серологическая реакция.

В ней участвуют комплемент и две системы антиген-антитело. По существу, это две серологические реакции.

Правая система-основная состоит из антигена и антитела (один известный, др. нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплимент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной.

В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый имунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой, то во второй системе гемолиза не будет- т.к.

нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то имунный комплекс не образуется и комплимент останется свободным. Оставшийся свободным, комплимент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, результат РСК отрицательный(содержимое пробирок прозрачно-"лаковая кровь").

Компоненты, реакции связывания комплемента:

Антиген — обычно лизат, экстракт, гаптен,

реже взвесь микроорганизмов.

2. Антитело — сыворотка больного.

3. Комплемент — сыворотка морских свинок.

Антиген — эритроциты барана.

5. Антитело — гемолизин к эритроцитам барана.

6. Изотонический раствор.

Ввиду того, что в РСК участвует большое количество сложных компонентов,

они должны быть предварительно оттитрованы и взяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5 или 0,25 , реже по 0,2,1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают более точный результат). Титрование компонентов реакции проводят в том же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающие ингредиенты изотоническим раствором.

Похожая информация:

Поиск на сайте:

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА - на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена.

В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

• фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами.

  Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;

• обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
• сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

• к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
• смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
• учитывают результаты.

  Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.

РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

• обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
• обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа.

Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Вконтакте

Одноклассники

В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела.

Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами. называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.

Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА).

Реакция пассивной гемагглютинации является чувствительным методом серологической диагностики и используется как для ранней, так и ретроспективной диагностики, а также для определения иммунопогического состояния привитых. У больных туляремией aнтитела обычно обнаруживаются в конце 1-ой или на 2-ой неделе заболевания, через 1-1,5 месяца титры РПГА достигают максимальных показателей (1:100000- 1:20000, реже выше), после чего снижаются и на уровне 1:100-1:200 сохраняются длительное время.

У привитых антитела также обнаруживаются постоянно, однако, в более низких титрах, не превышающих 1:2000-1:5000 через 1-1,5 месяца после вакцинации, сохраняются в течение нескольких лет на низком уровне 1:20-1:80.

Антигеном для постановки РПГА служит туляремийный эритроцитарный диагностикум (антигенный).

Препарат представляет собой формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные туляремийным антигеном, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат — 10%-ная взвесь эритроцитов в растворе формалина 10%-ной концентрации. Сухой лиофилизированный препарат — высушенная в вакууме 10%-ная взвесь эритроцитов без консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки реакции в полистироловых пластинах оба препарата применяют в 2,5%-ной концентрации, а при постановке реакции в микрообъемах — в 0,5%-ноq концентрации.

Техника постановки РПГА.

Испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором 1:5 (1:10) и прогревают при 56 град.С в течение 30 минут.

Реакция гемагглютинации (РГА) и

После этого в целях удаления гетерогенных антител к бараньим эритроцитам, сыворотки обрабатывают 50%-ной взвесью формалинизированных бараньих эритроцитов. Для этого эритроциты добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки и тщательно перемешивают встряхиванием.

Сыворотку оставляют до полного оседания эритроцитов, либо центрифугируют после одночасовой выдержки при комнатной температуре, после чего она готова к исследованию.

Разводящую жидкость разливают в объеме 0,5 мл в ряд лунок полистироловой пластины.

При предварительном исследовании сывороток их целесообразно испытывать путем постановки реакции в коротком ряду пластины (6-лунок). В случае выявления антител в коротком ряду сыворотки повторно исследуют в длинном ряду разведений (12 лунок).

После разлива разводящей жидкости, в первую лунку каждого ряда (короткого или длинного) добавляют по 0,5 мл испытуемых сывороток в разведении 1:5. Затем в тех же объемах сыворотки титруют двукратными разведениями. Таким образом, получают разведения сыворотки в коротком ряду с 1:10 до 1:320, а в длинном — с 1:10 до 1:20480. После титрования сывороток в каждую лунку добавляют по одной капле (0,05 мл) рабочей 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов.

Содержимое пластин тщательно встряхивают до получения гомогенной суспензии. Пластины оставляют при комнатной температуре на неподвижной поверхности стола. Предварительный учет реакции производят через 2-3 часа, окончательное определение титра производят после полного оседания эритроцитов в лунках. К реакции предусматривают следующие контроли: 1) испытуемая сыворотка в разведении 1:10 в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 2) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов; 3) разводящая жидкость в объеме 0,5 мл + 1 капля 2,5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов.

Все контроли должны дать четко отрицательную реакцию.

Учет и оценка РПГА. Оценку реакции производят по следующей схеме:

1) резко положительная реакция (++++) — эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», у которого нередко наблюдается фестончатое оплывание краев;

2) положительная реакция (+++) — эритроциты устилают не менее 2/3 дна лунки;

3) слабоположительная реакция (++) — агглютинат небольшой и расположен в самом центре лунки;

4) сомнительная реакция (+) — вокруг осадка эритроцитов в самом центре лунки имеются отдельные зерна агглютината;

5) отрицательная (-) — на дне лунки эритроциты оседают в виде «пуговки» или маленького колечка с ровными, резко очерченными краями.

Титр сыворотки учитывают по последнему разведению сыворотки, которое дало вполне четкую реакцию (не менее трех плюсов).

Диагностическим титром считается разведение 1:100 и выше, однако, так же как и в случае РА необходимо проследить за его нарастанием.

РПГА при туляремии является достаточно специфичной и обнаруживает некоторые перекрестные реакции только с бруцеллезными сыворотками. Дифференциальная диагностика возможна по высоте титров в РПГА, которые значительно выше с гомологичным антигеном.

Техника постановки РПГА в микрообъемах.

РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками), который позволяет осуществлять титрование материала в объемах 25 мкл и 50 мкл. Техника постановки реакций, последовательность всех операций такая же, как и при исследовании в полистироловых пластинах. Следует, однако, иметь в виду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е.

в 2 раза) ниже, чем макрометода.

Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки — капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забирают исследуемую сыворотку, погружая в нее головку.

Следует убедиться, что жидкость заполнила головку титратора. Титратор с сывороткой переносят в первую лунку и, держа его в вертикальном положении, делают несколько вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной водой (со сменой 2-х порций) путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и обжигают ее на пламени горелки.

В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного диагностикума.

Концентрация диагностикума для РПГА в микрообъемах должна составлять 0,5% (т.е. 2,5%-ную взвесь эритроцитов дополнительно разводят в 5 раз). После добавления эритроцитов пластины следует слегка потрясти до получения гомогенной взвеси. Учет результатов может быть произведен уже через 1-1,5 часа, в чем существенное преимущество РПГА в микротитраторе.

Кроме того, этот прием требует малого количества всех ингредиентов реакции и испытуемых сывороток.

Учет реакции производят по следующей схеме:

1) «+» – полноценная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде «зонтика», занимающего не менее 2/3 дна;

2) «+-« — частичная гемагглютинация, при которой эритроциты выпадают на дно в виде рыхлого кольца небольшого размера;

3) «-« – отсутствие гемагглютинации, когда эритроциты выпадают на дно в виде маленькой пуговки или колечка с ровным краем.

Специфичность положительного результата, полученного в РПГА, может быть проверена с помощью трехкомпонентной реакции – реакции mторможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

Техника постановки РТПГА.

Эту реакцию ставят для подтверждения специфичности положительного результата РПГА, когда он вызывает сомнение или представляет особый эпидемиологический интерес. Механизм реакции заключается в специфическом торможении гемагглютинации при добавлении к испытуемой сыворотке взвеси убитых туляремийных бактерий. В реакции взаимодействуют три компонента: испытуемая сыворотка, специфический туляремийный антиген и антигенный эритроцитарный диагностикум РТПГА обычно ставят в ряду из 7-8 лунок.

Целесообразно параллельно с РТПГА ставить повторную РПГА. В два ряда лунок разливают по 0,25 мл разводящей жидкости, затем в первые лунки обоих рядов вносят испытуемую сыворотку в объеме 0,25 мл и производят титровании Получают два одинаковых ряда разведений сыворотки. Во все лунки второго ряда добавляют по 0,25 мл разводящей жидкости, а в лунки первого ряда — по 0,25 мл взвеси туляремийных бактерий.

Используют туляремийный диагностикум (содержащий 25 млрд. туляремийных бактерий в 1 мл), предварительно разведенный в 50 раз.

Такая взвесь содержит 500 млн. бактерий в 1 мл или 125 млн. в объеме 0,25 мл. После добавления антигена пластину оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, пластину встряхивают и оставляют на ровной поверхности стола.

Учет производят через 2-3 часа.

Учет и оценка РТПГА. Если в испытуемой сыворотке содержатся специфические туляремийные антитела, они нейтрализуются добавленным антигеном и в первом ряду лунок гемагглютинации не произойдет, или, при высоком титре сыворотки, гемагглютинация будет отмечаться в меньшем (на 2-4) количестве лунок, чем в ряду с РПГА. В этом случае специфичность результатов подтверждена.

Если же гемагглютинация будет отмечена в обоих рядах, т.е. результаты РТПГА и РПГА совпадут, то это свидетельствует об отсутствии в испытуемой сыворотке туляремийных антител. В таком случае первичный результат РПГА признается неспецифическим.

Техника постановки РТПГА в микрообъемах. РТПГА, также как и РПГА, может быть выполнена в микрообъемах с использованием микротитратора типа Такачи.

Для этого в лунки микропластинок вносят по 0,25 мкл разводящей жидкости в два ряда по 7-8 лунок в каждом. Затем с помощью титратора забивают по 0,25 мкл исследуемой сыворотки и титруют ее в обоих рядах. После этого в первый ряд вносят по 25 мкл туляремиймого антигена (концентрация которого 500 млн. туляремийных бактерий в 1 мл) в каждую лунку, а во второй — 25 мкл разводящей жидкости.

Пластины оставляют на 1 час при комнатной температуре, после чего во все лунки обоих рядов добавляют 25 мкл антигенного зритроцитарного диагностикума (0,5%-ной концентрации).

Учет и оценку результатов производят аналогично реакции в макрообъемах.

Дата публикования: 2015-02-03; Прочитано: 3176 | Нарушение авторского права страницы

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год.(0.003 с)…

Существует множество методов качественного и количественного определения вирусоспецифических антител. С помощью этих методов можно обнаружить как IgM и IgG одновременно, так и отдельно иммуноглобулины каждого класса. Как правило, в реакции связывания комплемента выявляются только вирусоспеци-фические IgG. Однако при тестировании этим методом микробиологических антигенов возможно одновременное определение специфических IgM и IgG.

Иммунологические методы используются главным образом в двух целях: во-первых, для диагностики текущей, завершившейся или врожденной вирусной инфекции и, во-вторых, для обнаружения специфических антител, присутствие которых указывает на прошедшую инфекцию и, следовательно, на иммунитет к возможной повторной инфекции. По силе иммунного ответа на вирусную инфекцию люди сильно отличаются друг от друга. На рис. 3 показана типичная кривая нарастания титра

антител в ответ на первичную инфекцию краснухи. Легко заметить, что установление диагноза краснухи возможно по нарастанию титра специфических IgG и выявлению специфических IgM. Присутствие специфических IgM в крови новорожденного свидетельствует о внутриматочном инфицировании, поскольку материнские IgM в отличие от IgG задерживаются плацентой. Специфические IgG, образовавшиеся в результате первичной инфекции, обычно сохраняются в течение всей жизни. Поэтому присутствие антител этого класса в сыворотке крови свидетельствует об иммунитете к соответствующей повторной инфекции.

Ниже приведены иммунологические методы обнаружения специфических антител к вирусу краснухи, особенно эффективные для диагностики заболевания плода и определения титра специфических антител в сыворотке крови. Подробные описания методов, используемых для диагностики краснухи, можно найти в обзорах Паттисона и Моргана-Капнера.

Реакция торможения гемагглютинации

Вирус краснухи вызывает гемагглютинацию эритроцитов многих видов животных. Чаще всего в РТГА используют эритроциты однодневных цыплят. Гемагглютинирующим антигеном вируса краснухи при постановке этой реакции служит выращенный в культуре и обработанный Твин 80 и эфиром вирус. Предварительная обработка увеличивает ГА-титр вируса.

5.1.1 Стандартизация ГА-антигена вируса краснухи

1. 1 мл 50%-ной суспензии эритроцитов цыплят трижды промывают в вероналовом буфере с декстраном и желатином центрифугированием и ресуспендированием осадка в 15-мл градуированной центрифужной пробирке. Отмытые клетки ресуспендируют в DGV-буфере для получения 30%-ной суспензии.

Таблица 3. Приготовление вероналового буфера с декстраном и желатином

2. Разводят лиофилизированный препарат ГА-антигена вируса краснухи в требуемом по инструкции объеме дистиллированной воды.

3. В каждую из восьми лунок двух соседних рядов 96-луноч-ного полистиролового планшета для микротитрования с U-об-разными лунками вносят по 1 объему DGV.

4. В первые лунки двух рядов вносят по одному объему ГА-антигена вируса краснухи.

5. Готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена вируса краснухи, начиная от 1:2 и до 1:256, используя 0,025-мл микротитратор. Перед употреблением головку микро-титратора следует прокалить в пламени докрасна, затем остудить в течение нескольких секунд, поместить в дистиллированную воду и промакнуть фильтровальной бумагой.

6. В каждую из заполненных лунок дополнительно вносят по одному объему DGV-буфера. В качестве контроля в лунки 12 первых двух рядов вносят по два объема DGV-буфера.

7. Суспензию отмытых эритроцитов цыплят разводят в 100 раз DGV-буфером, получая таким образом 0,03%-ную суспензию.

8. Во все 18 лунок добавляют по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов, готовый планшет закрывают другим, неиспользованным планшетом и инкубируют 1 ч при 4 °С.

9. На дне контрольных лунок образуется плотная «бляшка» неагглютинированных эритроцитов. Агглютинированные эритроциты оседают равномерно. ГА-титром считают обратную величину наибольшего разведения ГА-антигена вируса краснухи, при котором еще происходит полная агглютинация. Такое разведение содержит 1 гемагглютинирующую единицу.

Для тестирования сывороток используют 4 ГА-единицы антигена вируса краснухи. Таким образом, если ГА-титр антигена равняется 32, то для обнаружения антител к вирусу краснухи его разводят DGV в восемь раз. Разведенный антиген стабилен в течение 25--48 ч при 4 °С.

5.1.2 Предварительная обработка сыворотки

Все сыворотки содержат неспецифические ингибиторы гемаг-глютинации, которые следует удалить. Неспецифические ингибиторы ГА в основном представляют собой липопротеины, от которых освобождаются, обрабатывая сыворотку каолином. В сыворотках человека, кроме того, могут присутствовать неспецифические агглютинины куриных эритроцитов. Однако предварительная адсорбция тестируемых сывороток эритроцитами не является обязательной, поскольку все неспецифические гемагглютинины, присутствующие в сыворотках, обнаруживаются в контролях.

1. В стеклянные пронумерованные пробирки вносят по 0,2 мл сыворотки. Кроме исследуемых сывороток в каждом опыте необходимы положительные и отрицательные контроли.

2. В каждую пробирку добавляют по 0,8 мл 25%-ного каолина на боратно-солевом буфере.

3. Содержимое пробирок взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин.

4. Отработанный каолин осаждают центрифугированием в настольной центрифуге при 2000 об/мин 20 мин.

5. Супернатант переносят в чистые пронумерованные пробирки. В результате очистки получают сыворотки, разбавленные в четыре раза. Их используют для постановки реакции торможения гемагглютинации. Сыворотки можно хранить при 4 °С в течение ночи.

5.1.3 Реакция торможения гемагглютинации

1. Для тестирования одного образца сыворотки вносят по одному объему DGV в один ряд лунок.

2. В первую и последнюю лунки добавляют по одному объему сыворотки, разведенной в четыре раза.

3. С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки.

4. В лунки 1--10 вносят по одному объему ГА-антигена краснухи, содержащего 4 ГАЕ. В лунку 12 ГА-антиген краснухи не добавляют.

5. В лунки 1--8 другого планшета вносят по одному объему рабочего разведения ГА-антигена краснухи, и затем в восьми лунках готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена. В эти 16 лунок добавляют по одному объему DGV. Это титрование является проверочным для ГА-антигена краснухи. Для контроля в лунки 12 первого и второго рядов вносят по два объема DGV.

6. Закрытые планшеты оставляют на 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °С.

7. Во все заполненные лунки вносят по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов цыплят и планшеты оставляют на 1 -- 1,5 ч при 4 °С.

8. Просматривая планшеты, определяют титр ГА-антигена краснухи. В контрольных лунках агглютинация не должна произойти.

9. Если же сыворотка агглютинировала эритроциты в отсутствие ГА-антигена краснухи, необходимо провести повторное тестирование исходного разведения сыворотки. Перед этим сыворотку адсорбируют одной каплей 30%-ной суспензии эритроцитов цыплят 1 ч при комнатной температуре, а затем эритроциты осаждают центрифугированием.

10. Титром специфических антител в исследуемой сыворотке считают обратную величину разведения, при котором полностью подавляется гемагглютинация.

5.1.4 Интерпретация результатов

При невысоком титре интерпретировать результаты сложно, так как при небольшом разведении возможно остаточное присутствие неспецифических ингибиторов. Наличие вирусоспецифических антител считается доказанным при титре 16 или выше.

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации (РТГА) позволяет с ее помощью определить вид и даже тип вирусов, обнаруженных при постановке РГА.

Поставка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки в последовательных двукратных разведениях от 1:10 до1:2560 смешивают с равным объемом материала, содержащего вирус, разведенного в 4 раза меньше титра, установленного в РГА. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 мин, после чего добавляют по 0,5 мл 1-2% взвеси эритроцитов.

Реакцию сопровождают 3 контролями.

Учет результатов производят после второй инкубации в термостате 30 или 45 мин при комнатной температуре. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» - нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» - вирус вызвал агглютинацию эритроцитов.

В опыте, если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» - сыворотка нейтрализовала вирус. Титр сыворотки – это ее максимальное разведение, в котором происходит задержка гемагглютинации.

Реакция непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приоб­ретают способность агглютинироваться при взаимодей­ствии с антителами к адсорбированному антигену. РНГА широко применяют при диагностике ряда инфекций.

Постановка реакции. Испытуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56 °С, разводят последовательно в соотношении 1:10-1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума (эритроциты с адсорбированным на них антигеном).

Рис.70 Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

А - получение эритроцитарного диагностикума; Б -РПГА: 1-эритроцит: 2 - изу­чаемый антиген: 3 - эритроцитарный диагностикум; 4 - антитело к изучаемому антигену; 5 - агглютинат.

Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммун­ной сывороткой; взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть.

При помощи РНГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты адсорбировать заведомо известные антитела.

Реакцию гемагглютинации можно ставить в объеме 0,025 мл (микрометод), пользуясь микротитратором Такачи.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ

В реакции преципитации происходит выпадение в оса­док специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, (аптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.

Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реак­ции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.

Реакцию преципитации обычно применяют для опреде­ления антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для опреде­ления видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установле­нии фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:

1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100 000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию.
Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5-1:10.

2. Антиген - растворенные вещества белковой или
липоиднополисахаридной природы (полные антигены и
гаптены).

3. Изотонический раствор.

Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).

Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципита­ции, должны быть совершенно прозрачными.

Рис.71 Реакция преципитации: А - реакция кольцепреципитации; Б - реакция преципитации по Оухтерлони

Реакция кольцепреципитации. В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2 - 0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторож­но наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Про­бирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное «кольцо» - преципитат (см. рис. 48).

Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустит­ся на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.

Схема постановки реакции кольцепреципитации

Таблица №13

Примечание. + наличие «кольца»; - отсутствие «кольца».

Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. «Кольцо» во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфиче­скую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках «колец» не должно быть - там нет соответству­ющих друг другу антител и антигенов. «Кольцо» в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой им­мунной сыворотке, отсутствие «кольца» («кольцо» только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.

Реакция преципитации в агаре (геле). Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсут­ствие полосы свидетельствует о несоответствии компонен­тов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изу­чении токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции
преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).

Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компо­нентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или анти­генов. При положительном результате изменяется цвет хромоге­на. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,

I. При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сы­воротку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, ме­ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

II. При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорби­рованными антителами вносят антиген (напр., сыворотку кро­ви с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыво­ротку против него и вторичные антитела (против диагностиче­ской сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хро­моген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.

Другой тест - Конкурентный ИФА для определения антител: искомые анти­тела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с дру­гом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг - высокочувстви­тельный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг ис­пользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагуили нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антиге­нов. На эти полоски наносят сыворотку больного . Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител боль­ного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.