Kuzuia kinga mwilini. Utambuzi wa UKIMWI kwa kuzuia kinga kwa VVU

Immunoblotting ni kipimo cha uchunguzi kinachofanywa katika hali ya maabara, ambayo matokeo yake yanafunua antibodies kwa vimelea vya magonjwa. magonjwa mbalimbali. Moja ya haya ni virusi vya ukimwi wa binadamu. Inafaa kuzingatia mara moja kwamba utafiti kama vile kuzuia kinga ya VVU ni hatua ya ziada ambayo imeagizwa ili kuthibitisha matokeo mazuri ya ELISA.

Virusi vya Upungufu wa Kinga ya binadamu ni maambukizi yanayoendelea polepole. Kuanzia wakati vimelea huingia ndani ya mwili hadi dalili za kwanza zinaonekana, muda mrefu sana hupita, ambayo inaweza kufikia miaka kadhaa.

Washa hatua ya awali maendeleo maonyesho ya kliniki inaweza kukosa. Ukuzaji joto la jumla, malaise, koo, dalili za tabia ya maambukizi ya VVU, mtu huchanganya na baridi ya kawaida, lakini maambukizi yanaendelea kuendelea. Kwa hiyo, wataalam katika vituo vya VVU wanapendekeza kupitia utambuzi wa kina katika hali kama hizi:

• ikiwa ulifanya ngono bila kinga na mwenzi mpya;
• ikiwa sindano ya matibabu ya ziada au sindano ilitumiwa tena;
• ikiwa hivi karibuni umekuwa na tattoo au kutoboa;
• ikiwa maambukizi mengine yanagunduliwa, njia ya maambukizi ambayo ni ya ngono (kwa mfano, syphilis, vaginosis ya bakteria, kisonono);
• ikiwa umekutana na mtu aliyeambukizwa.

Immunoblot kwa VVU inafanywa kwa kutumia serum au plasma. Utafiti kwenye kipande kimoja unahitaji 1.5-2 ml ya damu au 15-25 µl ya seramu.

Uchunguzi wa uchunguzi hufanya iwezekanavyo kuchunguza antibodies sio tu kwa virusi vya ukimwi wa binadamu, lakini pia kwa magonjwa mengine. Wakati wa utafiti, vifaa maalum hutumiwa ambavyo ni maalum kwa magonjwa anuwai, kwa mfano:

• HSV1 na HSV2 IgM/IgG (kugundua malengelenge maambukizi ya virusi);
• Profaili ya TORCH IgM (kugundua toxoplasmosis, rubella, maambukizi ya cytomegalovirus, HSV 1 na HSV 2);
• EBV IgMTIgG (kugundua maambukizi ya virusi vya Epstein-Barr);
• HCV IgG (kugundua hepatitis ya virusi aina C).

Matokeo ya immunoblotting yanaweza kuwa chanya (wakati antibodies hugunduliwa) na hasi (wakati antibodies haipo katika nyenzo za kibaiolojia), pamoja na isiyojulikana, chanya cha uongo na hasi ya uongo.

Unaweza kupima wapi maambukizi ya virusi, na nini cha kufanya baadaye?

Kila kliniki, maabara ya kibinafsi, hospitali, kliniki inataalam katika shughuli kama hizo za utambuzi. Unaweza kupima katika kituo cha kupima VVU. Baadhi ya kliniki za kibinafsi hutoa ushauri nasaha na kupima UKIMWI na VVU nyumbani.

MUHIMU! Baada ya kupokea matokeo ya utafiti, unahitaji kuwasiliana na daktari wako ili kuagiza tiba inayofaa.

Vipimo chanya

Ikiwa matokeo ya immunoblot ni chanya, hii haina maana kwamba maambukizi ya VVU yanaendelea katika mwili. Ili kuthibitisha utambuzi, tafiti nyingine zinaagizwa, kwa mfano, immunofluorescence isiyo ya moja kwa moja.

Ingawa njia ya immunoblot ni nyeti sana, kwa sababu ya uamuzi wa immunoglobulins ya darasa G, inawezekana kugundua kwa uwongo. matokeo chanya katika wiki 3 za kwanza baada ya kuambukizwa. Katika kesi hii, mtihani unarudiwa baada ya muda fulani.

Sababu zote za kupata matokeo chanya ya uwongo hazijulikani. Vyanzo vya kawaida ni ujauzito na utawala wa hivi karibuni wa chanjo ya kukandamiza kinga. Ikiwa, baada ya muda fulani kupita baada ya kufichuliwa na mambo hayo, immunoblot ya VVU bado ni chanya, hii ina maana kwamba mtu ameambukizwa.

Matokeo hasi

Kinga ya kinga inaweza kutoa matokeo mabaya, ambayo yanaashiria kutokuwepo kwa kingamwili kwa maambukizo ya VVU katika mwili na, kama matokeo, katika afya kamili.

Immunoblot hasi mara nyingi huzingatiwa wakati wa "kipindi cha dirisha" (miezi 3 ya kwanza kati ya maambukizi na kuonekana kwa antibodies katika damu). Katika kipindi hiki, mtihani hauoni antibodies zinazofanana, lakini katika maji mengine (manii, kutokwa kwa uke) zinaweza kugunduliwa kwa kiasi kikubwa.

Uchambuzi unafanywaje?

Immunoblot inaruhusu kutambua antibodies kwa kuchunguza damu na kutumia electrophoresis ya gel.

Kwanza kabisa, seli za bakteria au virions zinaharibiwa na ultrasound, baada ya hapo antigens zote za virusi au seli za bakteria zinatenganishwa na electrophoresis. Matokeo yake ni reagent ya kibiashara iliyowekwa kwenye filamu maalum ya nitrocellulose.

Wakati wa kuzuia kinga, seramu ya mtihani pia hutumiwa kwa nyenzo na antijeni inayojulikana. Baada ya incubation na kuosha antibodies unbound, kuanza immunoassay ya enzyme, immunoglobulins, ambazo zimeandikwa na enzyme, na substrate ya chromogenic ambayo hubadilisha rangi inapogusana na enzyme hutumiwa kwenye seramu.

Ikiwa kingamwili zipo, madoa yatatokea kwenye mtoaji.

Mbinu ya mstari

Linear blot kwa VVU ni kipimo kisicho cha moja kwa moja cha kinga ambacho hutoa kiashirio cha ubora cha kingamwili za darasa la IgG.

Wakati wa utafiti wa immunological hutumia dutu ya virusi Muundo wa VVU au antijeni. Katika maabara, protini za VVU zinajumuishwa na antibodies ya mtu binafsi ambayo yalipatikana kutoka kwa seramu ya damu. Ifuatayo, incubation hufanywa kwa kuongeza kingamwili zilizo na alama na immunoglobulin ya binadamu.

Utambuzi wa VVU kwa watoto wachanga

Katika mwili wa mtoto chini ya miezi 9 aliyezaliwa kutoka kwa mwanamke aliyeambukizwa, antibodies kwa VVU ya mama iko, ambayo husababisha matokeo ya uongo ya ELISA. Kwa sababu hii, upendeleo hutolewa kwa vipimo vya virological - uchambuzi wa kiasi cha RNA na DNA PCR. Njia ya kitamaduni ya kugundua maambukizo ni nyeti zaidi.

MUHIMU! Dalili za kutekeleza hatua za uchunguzi ili kugundua maambukizi ya VVU kwa watoto wachanga ni: kuzaliwa kutoka kwa mwanamke aliyeambukizwa, kupata matokeo ya shaka kutokana na uchambuzi uliofanywa hapo awali.

Mtihani wa ujauzito

Kwa kuwa maambukizi ya VVU yanayoendelea kwa mwanamke mjamzito yanaweza kuambukizwa kwa mtoto ambaye hajazaliwa, inahitajika utambuzi wa mapema kwa virusi vya immunodeficiency.

Kwanza kabisa, kipimo cha immunosorbent kilichounganishwa na enzyme hutumiwa kama mtihani wa uchunguzi. Kipimo cha uchunguzi husaidia kuchunguza antibodies kwa maambukizi katika seramu ya damu. Licha ya matokeo sahihi ya uchambuzi wakati wa ujauzito, kupima mara kwa mara kunahitajika.

Aina ya ELISA ni immunoblotting, ambayo mara nyingi hutumiwa wakati wa ujauzito. Kulingana na matokeo ya uchunguzi, inawezekana kutambua antibodies kwa antigens fulani, ambayo husambazwa na uzito wa Masi kwa kutumia electrophoresis.

Jinsi ya kupita mtihani kwa usahihi

Immunoblotting kwa VVU inahitaji mafunzo maalum kama njia zingine za utambuzi wa ugonjwa. Ikiwa unaweza kufanya tafiti kadhaa na kupata matokeo ya viashiria fulani kwa siku nzima (kwa mfano, majibu kwa allergen), basi unahitaji kutoa damu kwa mtihani wa kinga tu asubuhi.

Kusimbua matokeo

Kusimbua matokeo ya immunoblot yanafanywa na mfanyakazi wa maabara. Ikiwa protini 2 kati ya 3 za VVU-1 au VVU-2 hugunduliwa, hii inaonyesha kuwepo kwa maambukizi yanayofanana katika mwili. Utafiti unafanywa ili kuthibitisha immunoassay chanya ya enzyme. Kwa hivyo, majibu pia hujaribiwa kwa protini kama vile gp120/160, gp41 pamoja na p24. Mwisho ni sehemu ya jeni tatu za UKIMWI - gag pol na env.

Utambuzi wa kimsingi unahusisha utafiti wa protini p25, gp110/120 na gp160, ikionyesha hatua ya awali maendeleo ya ugonjwa huo. Ikiwa immunoassay ya enzyme ya pili ya serological inatoa matokeo mazuri, immunoblot inafanywa. Ikiwa mwisho pia hutoa matokeo mazuri, uchunguzi wa VVU unathibitishwa.

Uwezekano wa matokeo mazuri inategemea kipindi ambacho kimepita kutoka wakati wa kuambukizwa hadi utambuzi:

• baada ya siku 28 - 60-65%;
• baada ya siku 42 - 80%;
• baada ya siku 56 - 90%;
• baada ya siku 84 - 95%.

Matokeo chanya ya uwongo yanawezekana ikiwa sampuli nyenzo za kibiolojia kwa uchunguzi zaidi ulifanyika wakati wa ujauzito, katika kesi ya ukiukwaji viwango vya homoni, ukandamizaji wa muda mrefu kazi ya kinga dawa fulani ambazo mtu anatumia.

Vigezo vya Tathmini ya Uchambuzi

Matokeo ya ELISA na uchambuzi wa immunoblotting lazima yakidhi vigezo vifuatavyo:

• doa la nyenzo za kibayolojia chini ya utafiti linalingana na doa la sampuli ya marejeleo;
• uzito wa molekuli ya sehemu kuu iliyotambuliwa hukutana na mahitaji ya vipimo.

Uchafu uliotambuliwa na maudhui yake lazima yatimize mahitaji ya cheti cha nyenzo za marejeleo.

Matokeo yasiyoweza kufasiriwa

Katika baadhi ya matukio, immunoblotting kwa VVU na UKIMWI hailingani na matokeo mabaya na mazuri, na daktari hawezi kuamua sababu halisi habari zenye mashaka. Mara nyingi sababu ya tafsiri mbaya ni maambukizi yanayosababishwa na serotype nyingine.

Ili kuondoa mashaka, PCR na ELISA hufanyika katika mienendo. Kwa kutokuwepo tabia ya ugonjwa huo dalili kwa miezi sita na sababu za hatari zinaonyesha afya kamili. Katika hatua hii hatua za uchunguzi wanahitimu.

Matokeo ya kutiliwa shaka yanaweza pia kupatikana ikiwa ugonjwa mwingine wa kuambukiza, kansa, au mmenyuko wa mzio hutokea katika mwili.

Muhimu! Ikiwa matokeo ni ya shaka, mtu hawezi kuwa mtoaji wa damu au nyenzo nyingine za kibiolojia.

Makosa ya kawaida wakati wa kugundua maambukizi ya VVU

Ukusanyaji wa nyenzo za kibiolojia, utoaji na usajili wa vifaa vinavyotumiwa wakati uchunguzi wa maabara, lazima izingatie sheria zifuatazo:

1. Nyaraka zinazoambatana zimetayarishwa zikionyesha jina la mfumo wa majaribio, tarehe ya kumalizika muda wake na mfululizo.
2. Maelezo ya pasipoti ya somo, tarehe, na mahali ambapo nyenzo za kibaolojia zilikusanywa zimeonyeshwa kikamilifu.
3. Seramu huhifadhiwa kwa muda mrefu zaidi ya kipindi kilichoanzishwa;
4. Nambari kwenye chupa inalingana na nambari iliyoonyeshwa kwa mwelekeo.
5. Mkusanyiko wa nyenzo za kibaolojia hutokea kulingana na sheria zilizowekwa, yaani, kutoka kwa mshipa wa ulnar. Damu inayojaribiwa haipaswi kuwa na vifungo.

Bomba la mtihani kavu hutumiwa kukusanya nyenzo. Damu ya kitovu mara nyingi huchukuliwa kutoka kwa watoto wachanga, ikionyesha ukweli huu kwa mwelekeo.

Makosa ya kawaida yaliyofanywa na madaktari ni kuhifadhi nyenzo zilizopatikana kwa zaidi ya masaa 12 joto la chumba na muda mrefu zaidi ya siku 1 kwa joto la nyuzi 4-8 juu ya Selsiasi. Kutokana na mwanzo wa hemolysis, matokeo ya utaratibu wa uchunguzi yanapotoshwa.

Hivyo kwa makosa ya kawaida Wakati wa utambuzi wa maambukizi ya VVU ni pamoja na:

• mkusanyiko usiofaa wa nyenzo za kibiolojia;
• uhifadhi usiofaa wa nyenzo za biopsy;
• usafiri usiofaa wa mifumo ya uchunguzi;
• uhifadhi wa muda mrefu wa mfumo wa mtihani.

Matokeo yake yanaathiriwa hata na ubora wa maji yanayotumiwa kuosha vyombo ambavyo nyenzo za kibaolojia huwekwa.

Baada ya kupokea matokeo ya mtihani, mfanyakazi wa maabara lazima atoe hitimisho kwa daktari. Ikiwa uchunguzi ulifanyika wakati wa "kipindi cha dirisha", anaagiza uchunguzi wa kurudia baada ya muda fulani. Kwa hali yoyote, kufanya uchunguzi wa maambukizi ya VVU, immunoblot moja haitoshi. Utambuzi wa kina unahitajika.

Damu inachukuliwa kutoka kwa mshipa. Kisha utafiti unaendelea kulingana na maagizo:

• sampuli huwekwa kwenye gel kwa kujitenga kwa electrophoretic, na kusababisha protini maalum ambazo ni nyeti kwa virusi;
• karatasi ya nitrocellulose hutumiwa kwa gel ya kutibiwa;
• sampuli iliyoandaliwa imewekwa kwenye kifaa cha kufuta.

Ili kutambua enzymes maalum, ni muhimu kuandaa vizuri karatasi utafiti wa maabara. Ili kufanya hivyo, kingamwili na kiunganishi cha mionzi kilichoandikwa hutumika kwake. Matokeo ya utafiti yanapimwa kwa macho, minyororo ya enzyme iliyojengwa inachunguzwa.

Kusimbua matokeo

Baada ya kudanganywa, michirizi hubaki kwenye karatasi. Ziko mahali ambapo muunganisho ulitokea, ambayo ni, dawa iliyotumiwa iliguswa na protini ya virusi. Kwa njia hii unaweza kugundua sehemu za protini:

• kutoka kwa msingi wa VVU-1 - p17, p24, p55;
• pathojeni VVU-2 - p16, p26, p56.

Matokeo ya kuzuia kinga huchukuliwa kuwa chanya ikiwa protini 2 kati ya 3 za VVU-1 au VVU-2 zitagunduliwa. Kwa kuwa blot ya Magharibi (jina la pili la utafiti) mara nyingi hutumiwa kuthibitisha ELISA chanya, majibu yanaangaliwa kwa protini maalum: gp120/160, gp41 au p24. Wao ni sehemu ya jeni tatu kuu za UKIMWI - gag, pol, na env. Saa utambuzi wa msingi mtihani unafanywa tu kwa protini p25, gp110/120 na gp160 ikiwa inatoa matokeo mazuri, basi mtihani unafanywa kwa p24; Sehemu hii ya protini inaruhusu virusi kugunduliwa katika hatua ya awali.

Matokeo mazuri ni sababu ya kutafuta uchunguzi ngumu zaidi. Ni uongo tu katika kesi 3:

• kwa wagonjwa wenye kiwango cha juu bilirubini;
• juu ya kuwasiliana na antijeni ya virusi;
• kwa pathologies ya tishu zinazojumuisha.

Ikiwa mgonjwa hana mistari inayolingana na protini za UKIMWI, basi matokeo yanatathminiwa kuwa hasi. Hii ina maana kwamba mtu huyo hajaambukizwa VVU au yuko katika kipindi cha dirisha. Mwisho unamaanisha kwamba virusi vinaweza kuingia ndani ya mwili, lakini bado haijaendelea ndani yake. Ili kuongeza usahihi wa utambuzi, mifumo ya mtihani hutumiwa:

• Recombinant-VVU;
• Antijeni;
• Peptoscreen.

Baada ya kuwaangalia, matokeo huchukuliwa kuwa hasi ikiwa protini gp120, gp160, Sp4 haipatikani kwenye sampuli.

Kuna chaguo jingine la tafsiri - matokeo ya upande wowote au ya shaka. Inatokea kwa wale ambao wana mawasiliano ya ngono na mpenzi aliyeambukizwa VVU. Kingamwili kwa protini gp120 na gp160 hupatikana katika damu yao. Pia, jibu la shaka wakati wa kufuta hutolewa wakati maambukizi hayana dalili, yaani, iko katika hali ya usingizi.

Ni muhimu kuangalia kwa uangalifu matokeo ya shaka. Kwa kusudi hili, utafiti wa nguvu wa serum ya damu hutumiwa, yaani, hundi ya mara kwa mara kwa kutumia immunoblotting na mbinu za ELISA kwa miezi sita. Uchunguzi wa ziada pia umewekwa, kwa kuwa uwepo wa autoantibodies katika damu na complexes ya kinga inaweza kuwa kutokana na:

• magonjwa ya kuambukiza;
• uwepo wa tumors za saratani;
• mzio.

Katika mazoezi ya uchunguzi wa maabara ya magonjwa ya kuambukiza, wakati mwingine kuna haja ya kuamua antibodies sio kwa pathojeni kwa ujumla, lakini kwa baadhi ya protini zake (antijeni), yaani, wigo wa antibodies maalum. Ikiwa kwa lengo hili njia ya uchunguzi wa immunosorbent unaohusishwa na enzyme hutumiwa, basi katika kesi hii ni muhimu kwanza kutenganisha na kutakasa antigens muhimu kutoka kwa utamaduni wa pathogen. Protini zinazozalishwa hutumiwa tofauti kwa awamu imara. Katika kesi ya kutumia sahani ya visima 96, aina moja ya antijeni imewekwa katika kila kisima. Kisha antibodies maalum imedhamiriwa na njia isiyo ya moja kwa moja.

Kwa uwepo wa mmenyuko mzuri katika kisima na antijeni fulani, mtu anaweza kuhukumu uwepo wa antibodies maalum zinazofanana. Aina hizi za mifumo ya mtihani wa immunoenzyme hutolewa na makampuni ya utengenezaji, lakini njia ya kuzuia kinga (Western blot) imeenea kutokana na maudhui yake ya habari zaidi na urahisi wa utekelezaji wa mtihani yenyewe.

Uzuiaji wa kinga huruhusu mtu kuamua antibodies katika seramu ya damu wakati huo huo na wakati huo huo tofauti kwa protini zote muhimu za uchunguzi wa pathojeni. Tafsiri kutoka Kiingereza Western blot ina maana ya uhamisho wa Magharibi (literally - blotting). Historia ya neno hili lisilo la kawaida ni kama ifuatavyo.

Mnamo 1975, mwanasayansi anayeitwa E. Southern alipendekeza kwanza njia ya kuhamisha vipande vya DNA vilivyotenganishwa kwa njia ya kielektroniki kutoka kwa gel hadi kwenye utando. Kulingana na mwandishi, njia hiyo iliitwa blot ya Kusini, ambayo ilitafsiriwa inamaanisha "uhamisho wa kusini". Njia ya kuhamisha molekuli za RNA, kwa upande wake, ilipewa jina la utani na wataalam Northern blot - "uhamisho wa kaskazini". Mwanzoni kama utani, na kisha jina hili liliwekwa katika fasihi rasmi ya kisayansi.

Mnamo 1979, G. Towbin alichapisha matokeo ya majaribio ya kwanza ya kuzuia protini. Katika muendelezo wa mila ya majina ya "kijiografia" kwa njia za uhamishaji wa macromolecules ya kibaolojia njia hii ilianza kuitwa uhamishaji wa "Magharibi" - blot ya Magharibi.

Hatua ya kwanza ya njia hii inahusisha mgawanyo wa electrophoretic wa mchanganyiko wa protini za pathojeni katika gel ya Polyacrylamide mbele ya sodiamu dodecyl sulfate (SDS). DSN, kuwa ya juu juu dutu inayofanya kazi, hufunika molekuli za protini sawasawa na kuzipa zote malipo hasi ya takriban ukubwa sawa. Kwa hiyo, molekuli huhamia kwenye uwanja wa umeme kwa mwelekeo mmoja, na kasi ya harakati inategemea tu ukubwa wa molekuli (uzito wa Masi) ya protini.

Kama matokeo ya utaratibu wa electrophoretic, sahani ya gel hupatikana, katika unene ambao protini ziko katika mfumo wa kanda nyembamba za mstari. Kulingana na mwelekeo wa harakati, wamegawanywa kwa mpangilio ufuatao: protini zilizo na uzani mkubwa wa Masi, karibu 120-150 kDa, ziko karibu na mwanzo, na protini zilizo na misa ya 5-10 kDa zimesonga mbali zaidi hadi mwisho. mstari. Katika hatua ya pili, sahani ya gel imewekwa kwenye karatasi ya nitrocellulose na muundo huu umewekwa kati ya electrodes ya chanzo cha moja kwa moja cha sasa. Chini ya ushawishi uwanja wa umeme protini hutiririka kutoka kwa gel ya porous hadi kwenye membrane mnene, ambapo huwa thabiti kabisa.

Kifuniko kinachosababishwa kinatibiwa na suluhisho la kuzuia lililo na protini zisizojali za antijeni na/au sabuni zisizo na uoni (Kati ya 20), ambazo huzuia tovuti zisizo na antijeni kwenye membrane. Kisha karatasi ya utando hukatwa kwenye vipande nyembamba ili kila kipande kiwe na sehemu zote za antijeni. Hatua zilizoelezwa zinafanywa na mtengenezaji.

Mifumo ya majaribio ya kibiashara ya kubainisha kingamwili kwa kutumia kingamwili ina madoa (vipande, au vipande) ambavyo viko tayari kwa majaribio. Mtumiaji huamua wigo mzima wa antibodies maalum kwa protini za pathojeni kulingana na mpango njia isiyo ya moja kwa moja. Dutu isiyo na rangi mumunyifu hutumiwa kama chromojeni kutekeleza mmenyuko wa rangi (enzymatic), bidhaa ambayo hupata rangi, inakuwa isiyoyeyuka na kutulia (inashuka) kwenye nitrocellulose.

Kama matokeo ya athari za kinga na enzymatic zinazofuatana, mbele ya antibodies kwa protini za pathojeni kwenye sampuli ya mtihani, kupigwa kwa giza kupita kiasi huonekana kwenye bloti, eneo ambalo liko katika ukanda wa protini fulani za pathojeni. Kila bendi hiyo inaonyesha kuwepo kwa antibodies maalum kwa antijeni inayofanana. Matokeo ya utafiti uliofanywa na immunoblotting hutolewa kwa namna ya orodha ya antibodies kwa protini maalum za pathogen. Kwa mfano: "kingamwili kwa protini p17 na p24 zimegunduliwa."

Matone ya nitrocellulose yanaweza kuhifadhiwa kavu kwa muda mrefu baada ya maendeleo. Walakini, ukali wa rangi hudhoofisha sana. Vipu vya mvua vinaweza kupigwa picha au picha zao za picha zinaweza kuingizwa kwenye kumbukumbu ya kompyuta za kibinafsi kwa kutumia scanners. Maalum programu za kompyuta kuruhusu kuchakata matokeo yaliyopatikana na kufuatilia kwa haraka mienendo ya wigo wa antibody wakati wa uchunguzi wa nguvu

Kuzuia kinga mwilini (immunoblot, Western Blot, blot ya magharibi)- inachanganya kipimo cha immunosorbent kilichounganishwa na enzyme (ELISA) na uhamisho wa awali wa electrophoretic wa antijeni za virusi kwenye strip ya nitrocellulose (strip).

Katika jina hili zuri la kisayansi, “blot” inaelekea kutafsiriwa kama “baa,” na “magharibi” kama “magharibi” huakisi mwelekeo wa kuenea kwa “baa” hili kwenye karatasi kutoka kushoto kwenda kulia, yaani, hadi. ramani ya kijiografia hii inalingana na mwelekeo kutoka magharibi hadi mashariki." Kiini cha njia ya "kinga ya kinga" ni kwamba mmenyuko wa immunoenzyme haufanyiki na mchanganyiko wa antijeni, lakini na antijeni za VVU, zilizosambazwa hapo awali na immunophoresis katika sehemu ziko kulingana na uzito wa Masi kwenye uso wa membrane ya nitrocellulose. Matokeo yake, protini kuu za VVU, flygbolag za viashiria vya antijeni, husambazwa juu ya uso kwa namna ya kupigwa tofauti, ambayo inaonekana wakati wa mmenyuko wa immunosorbent unaohusishwa na enzyme.

Immunoblot inajumuisha hatua kadhaa:

Maandalizi ya strip. Virusi vya Upungufu wa Kinga (VVU), vilivyosafishwa hapo awali na kuharibiwa katika sehemu zake za msingi, vinakabiliwa na electrophoresis, na antijeni zinazounda VVU hutenganishwa na uzito wa Masi. Kisha, kwa kutumia njia ya kufuta (sawa na kuminya wino wa ziada kwenye pedi ya kufuta), antijeni huhamishiwa kwenye ukanda wa nitrocellulose, ambayo sasa ina wigo wa bendi za antijeni tabia ya VVU, ambayo bado haionekani kwa jicho.

Uchunguzi wa sampuli. Nyenzo za mtihani (seramu, plasma ya damu ya mgonjwa, nk) hutumiwa kwa ukanda wa nitrocellulose, na ikiwa kuna antibodies maalum katika sampuli, hufunga kwa bendi za antijeni zinazolingana (zinazosaidia). Kama matokeo ya udanganyifu unaofuata, matokeo ya mwingiliano huu yanaonyeshwa - yanaonekana.

Ufafanuzi wa matokeo. Uwepo wa bendi katika maeneo fulani ya sahani ya nitrocellulose inathibitisha uwepo katika seramu iliyojaribiwa ya antibodies kwa antigens zilizofafanuliwa madhubuti za VVU.

Ukanda A - Udhibiti Chanya

Ukanda B - Udhibiti Mzuri dhaifu

Ukanda C - Udhibiti Hasi

Lane D - Sampuli chanya (kingamwili kwa VVU-1 imegunduliwa)

Hivi sasa, immunoblotting (immunoblot) ni njia kuu ya kuthibitisha kuwepo kwa antibodies maalum ya virusi katika seramu ya mtihani. Katika baadhi ya matukio ya maambukizi ya VVU, kabla ya seroconversion hutokea, antibodies maalum hugunduliwa kwa ufanisi zaidi na kuzuia kinga mwilini kuliko ELISA. Wakati wa kusoma kwa kutumia njia ya kuzuia kinga, iligundulika kuwa mara nyingi kingamwili za gp 41 ziligunduliwa katika seti ya wagonjwa wenye UKIMWI, na kugundua p24 kwa watu waliochunguzwa. kwa madhumuni ya kuzuia, inahitaji utafiti wa ziada kwa uwepo wa maambukizi ya VVU. Mifumo ya majaribio ya kuzuia kinga mwilini kulingana na protini za uundaji upya zilizoundwa kijenetiki imethibitishwa kuwa mahususi zaidi kuliko mifumo ya kawaida kulingana na lisati ya virusi iliyosafishwa. Wakati wa kutumia antijeni ya recombinant, sio kuenea, lakini mstari mwembamba wa antijeni uliofafanuliwa wazi huundwa, ambao unapatikana kwa urahisi kwa kurekodi na kutathminiwa.

Sera kutoka kwa watu walioambukizwa VVU-1 hufunua antibodies kwa protini kuu zifuatazo na glycoproteins - protini za bahasha za miundo (env) - gp160, gp120, gp41; msingi (gag) - p17, p24, p55, pamoja na enzymes ya virusi (pol) - p31, p51, p66. Antibodies kwa env ni kawaida kwa VVU-2 - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

Miongoni mwa njia za maabara muhimu ili kuanzisha maalum ya mmenyuko, inayojulikana zaidi ni kugundua antibodies kwa protini za bahasha za VVU-1 - gp41, gp120, gp160, na HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

WHO inazingatia sera chanya ambapo kingamwili kwa glycoproteini zozote mbili za VVU hugunduliwa kwa kuzuia kinga. Kwa mujibu wa mapendekezo haya, ikiwa kuna majibu na moja tu ya protini za bahasha (gp 160, gp 120, gp 41) pamoja au bila majibu na protini nyingine, matokeo huchukuliwa kuwa ya shaka na kupima tena kunapendekezwa kwa kutumia seti kutoka kwa mfululizo tofauti au kutoka kwa kampuni tofauti. Ikiwa hata baada ya hii matokeo yanabaki kuwa ya shaka, uchunguzi kwa miezi 6 unapendekezwa (utafiti baada ya miezi 3).

Uwepo wa mmenyuko mzuri na antijeni ya p24 inaweza kuonyesha kipindi cha seroconversion, kwani antibodies kwa protini hii wakati mwingine huonekana kwanza. Katika kesi hii, inashauriwa, kulingana na data ya kliniki na epidemiological, kurudia utafiti na sampuli ya serum iliyochukuliwa angalau wiki 2 baadaye, na hii ndiyo kesi hasa wakati kupima sera ya jozi ni muhimu katika maambukizi ya VVU.

Miitikio chanya ya protini za gag na pol bila mmenyuko na protini za env inaweza kuonyesha mabadiliko ya mapema ya seroconversion na pia inaweza kuonyesha maambukizi ya VVU-2 au athari isiyo maalum. Watu walio na matokeo haya baada ya kupima VVU-2 wanajaribiwa tena baada ya miezi 3 (ndani ya miezi 6).

Vipengele tofauti:

• Seti ya vitendanishi "MPBA - Blot - HIV-1, HIV-2" ina protini za virusi vya lysate zilizosafishwa za VVU 1 na peptidi - kiashiria cha antijeni gp36 ya VVU-2;
• Hutoa utambuzi wa antibodies kwa VVU-1, VVU-1 kikundi O, VVU 2 kwenye mstari mmoja;
• Utaratibu rahisi wa kuandaa na kufanya vipimo;
• Udhibiti wa ubora wa majibu ya ndani*
• Kasi ya juu zaidi kufanya uchambuzi (masaa 3);
• Kiasi kidogo cha sampuli ya mtihani - 20 µl;
• Haihitaji vifaa vya ziada kwa utafiti;
• Ubora wa seti unahakikishwa na matumizi ya sampuli za kiwango cha Kirusi na kimataifa **

* Udhibiti wa ubora wa ndani unahakikishwa na uwepo wa:

• vipande vya udhibiti wa ndani, hutoa udhibiti juu ya kuanzishwa kwa sampuli ya seramu au plasma;
• kudhibiti seramu hasi (K-);
• kudhibiti seramu chanya (K+), ambayo inaruhusu kutambua bendi zilizogunduliwa kwenye ukanda;
• kudhibiti seramu chanya dhaifu (K+cl), ambayo hutoa udhibiti wa unyeti wa vifaa vya kitendanishi.

**Uhakikisho wa ubora:

Sifa za kifaa cha kitendanishi cha “MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2” ziliamuliwa kwa kupima sampuli za sampuli nasibu za wafadhili, wagonjwa waliogunduliwa. Maambukizi ya VVU, paneli za ubadilishaji wa seroconversion za kibiashara, paneli za kawaida na sampuli zilizo na vipengee "vinavyoweza kuingilia".

Kitengo cha reagent haitoi matokeo chanya ya uwongo unaposoma sera za paneli za kawaida ambazo hazina kingamwili za VVU 1.2 na antijeni ya HIV-1 (“AT (-) Viwango vya VVU”, Na. FSR 2007/00953 ya tarehe 10.25.2007). Umaalumu - 100%.

Umaalumu wa uchunguzi ulibainishwa kwa kusoma sampuli nasibu ya wafadhili 200 kutoka vituo mbalimbali vya damu na kliniki ambazo hapo awali zilithibitishwa kutokuwepo kwa maambukizi ya VVU-1 na VVU-2. Umaalumu wakati wa kusoma sampuli ya nasibu ya wafadhili ilikuwa 100%;

Umaalumu wa vifaa vya kitendanishi ulibainishwa kwa kupima sampuli 250, zikiwemo sampuli za seramu au plasma zilizopatikana kutoka kwa wanawake wajawazito, wagonjwa waliolazwa hospitalini, wagonjwa wa hepatitis C na E, na sampuli zilizo na sehemu "zinazoweza kuingilia". Wakati wa kutumia MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 kit kwa sampuli hizi, hakuna matokeo chanya ya uongo yaligunduliwa.

Usikivu wa utambuzi umedhamiriwa kwa kutumia:
- sampuli za plasma kutoka kwa jopo la Boston Biomedica, Inc HIV-1 (WWRB 301) kutoka mikoa tofauti iliyo na aina ndogo za VVU-1: kikundi M (aina A, B, C, D, E, F), na kikundi O; uelewa wa kit reagent ilikuwa 100%;

Unyeti wa vifaa vya kitendanishi ulibainishwa katika utafiti wa paneli za kimataifa za kubadilisha mfumo wa kingamwili za Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), paka. nrs. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 90292, PRB 92928

Seti ya vitendanishi hutambua kingamwili za VVU-1 katika sera ya jopo la kawaida lenye antibodies kwa VVU-1 (“AT (+) HIV-1 Standard”, No. FSR 2007/00953 ya tarehe 25 Oktoba 2007), hutambua kingamwili VVU-2 katika sera ya paneli ya kawaida iliyo na kingamwili kwa VVU-2 (“AT (+) HIV-2 Standard”, No. FSR 2007/00953 ya tarehe 25 Oktoba 2007). Unyeti - 100%.

Cheti cha usajili No. FSR 2010/07958 cha tarehe 13 Julai 2011 (uhalali hauna kikomo)

Kiwanja:

• Immunosorbent. Vipande vya membrane ya nitrocellulose nyeupe na protini za mtu binafsi za VVU-1 (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17) zilizowekwa juu yao kwa njia ya umeme na kupakwa kwenye ukanda na peptidi ya syntetisk ya HIV-2, analog ya protini ya gp36 na IgG ya kupambana na binadamu ( udhibiti wa ndani) - pcs 18;
• K- - kudhibiti seramu hasi. Seramu ya damu ya binadamu ambayo haina antibodies kwa VVU-1,2, HCV, antijeni ya VVU, HBsAg, imezimwa na joto kwa 560C; kioevu cha rangi ya njano ya uwazi - 1 tube ya mtihani (0.08 ml). Ina vihifadhi: thimerosal na azide ya sodiamu;
• K+ - kudhibiti seramu chanya. Seramu ya damu ya binadamu iliyo na antibodies kwa VVU-1,2 (titer si chini ya 1: 10000), isiyo na HBsAg, antijeni ya VVU, antibodies kwa HCV, imezimwa na joto la 560C; kioevu cha njano cha uwazi - 1 tube ya mtihani (0.08 ml Ina vihifadhi: thimerosal na azide ya sodiamu;
• K+sl - kudhibiti seramu chanya dhaifu. Seramu ya damu ya binadamu iliyo na antibodies kwa VVU-1,2 (titer si zaidi ya 1:200), isiyo na HBsAg, antijeni ya VVU, antibodies kwa HCV, imezimwa na joto la 560C; kioevu cha rangi ya njano ya uwazi - 1 tube ya mtihani (0.08 ml). Ina vihifadhi: thimerosal na azide ya sodiamu;
• RPOKk (x10) - suluhisho la sampuli za diluting na conjugate. Kuzingatia - Tris buffer iliyo na seramu ya kawaida ya mbuzi iliyotibiwa kabla; kioevu kijivu opaque - chupa 1 (10 ml). Ina kihifadhi: thimerosal;
• PRk (x20) - suluhisho la kuosha. Kuzingatia - Tris bafa iliyo na Tween-20; kioevu isiyo na rangi ya uwazi - chupa 1 (70 ml). Ina kihifadhi: thimerosal;
• Unganisha. Kingamwili za mbuzi za IgG zilizounganishwa na phosphatase ya alkali; kioevu isiyo na rangi isiyo na rangi - 1 tube ya mtihani (0.06 ml);
• Substrate (suluhisho la kuchorea). Suluhisho la 5-bromo-4-fluoro-indolyl phosphate (BCIP) na nitroblue tetrazolium (NBT); kioevu cha manjano nyepesi - chupa 1 (50 ml);
• Poda kwa kuzuia kinga. Poda ya maziwa ya skim - nyeupe amorphous au poda ya njano nyepesi - pakiti 5 x 1g;
• Kibao na kifuniko kwa ajili ya kuanzisha majibu - vipande 2;
• Kibano cha plastiki - kipande 1.